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水杨酸钠对细菌内毒素引起的大鼠耳蜗诱导型一氧化氮合酶表达的影响

穆恩  
【摘要】: 前言 诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)催化合成的过量的一氧化氮(nitric oxide,NO)能引起广泛的组织损伤,并参与噪声、耳毒性药物、缺血、炎症等原因造成的耳蜗病理过程。对iNOS的抑制能减轻多种原因引起的内耳损害。研究发现,水杨酸钠能抑制离体肝细胞、心肌纤维母细胞、血管平滑肌细胞中iNOS的表达,提示水杨酸钠有可能通过对iNOS的抑制发挥在内耳的保护作用。本实验采用免疫组化方法观察水杨酸钠对细菌内毒素(lipoplysaccharide,LPS)引起的大鼠耳蜗iNOS表达的影响,并探讨水杨酸钠对耳蜗的保护性作用。 材料和方法 材料:取耳廓反射正常、体重250-300g的健康雄性Wista大鼠24只,耳显微镜检查鼓膜排除中耳炎。所有动物平均分为3组,分别为LPS组、NaSA/LPS一组和NaSA/LPS二组。经鼓膜向右侧鼓室注射浓度为5mg/ml的LPS0.5mg,左侧鼓室注射等量生理盐水。NaSA/LPS一组和NaSA/LPS二组动物在注射LPS前4小时分别经腹腔注射水杨酸钠200mg/kg和400mg/kg。LPS组动物腹腔注射等量生理盐水。方法:(1)ABR检测:在注射LPS前、注射后12、24小时测试ABR反应阈。备选动物在2%戊巴比妥钠40mg/kg腹腔注射麻醉下,在隔音的电屏蔽室内常规方法测试ABR,记录反应阈。用Danac-7型声刺激器行短声(click)刺激,频率20次/秒,扫描时间10ms,滤波100-3000Hz,声输出范围0-100dB,信号叠加128次,以ⅡⅢ波反应阈为标准判断听阈。 *)免疫组织化学检查:于注射LPS后每次检测ABR后每组取4 只动物处死。麻醉下开胸,4℃生理盐水经心脏灌流,冲出全部红 细胞后4%多聚甲醛灌流固定。断头,快速取出听泡,分离出耳 蜗,蜗尖打孔,开放圆窗。卵圆窗,将耳蜗置于相同固定液中24/J\ 时。甲酸一甲酸钠溶液脱钙一周,每日更换脱钙液。再移人30% 蔗糖溶液4℃下过夜。OCT包埋,沿蜗轴平行方向行10Pm厚切 片准备作免疫组化染色瞩ABC法人待切片在空气中干燥后,人 3%过氧化氢溶液10分钟去除内源性过氧化物酶;正常山羊血清 室温20分钟封闭;加一抗(兔抗鼠iNOS单克隆抗体人4℃过夜; 再加二抗(生物素化羊抗兔 IgG入室温孵育 20分钟后加链霉亲和 素一生物素一过氧化物酶复合物(咖PM10n-M。611-PP roiloi4PP C。mpl。,SABC乃7t反应 20分钟;二氨基联苯胺显色,光镜下控 制反应时间,蒸馏水终止显色,梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树 胶封片,光镜下观察。空白对照用PBS代替一抗,其余步骤不变。 采用Meta Morph电子计算机图像分析系统,测定iNOS阳性反应 物的平均灰度值,以均数上标准差表示,灰度值越大,说明组化反 应程度越低。各组ABR反应阈也以均数上标准差表示,用SAS统 计分析软件对结果进行方差分析,比较差异的显著性。 结 果 *注射Li的右耳ABR反应阈明显升高,其中以L.e组最为 显著,NaSA/脱一、二组的听阈升高明显低于Li组,经单因素 方差分析并行q检验发现,LPS组与NaSA/LPS一、二组的ABR阈 移相比差异具显著性O<o.05人*拐A/肥一、二组之间**R阈 移差异无显著性。左耳注射生理盐水后,ABR阈值略升高,但各 组之间比较差异光显著性。 2.注射e后,光学显微镜下观察,在耳蜗螺旋韧带、血管 ·2· 纹、螺旋神经节、柯替氏器的支持细胞等处有明显的iNOS表达, 以LPS组表达最强,NdA/肥一组其次,N aSA/aSA/班二组最弱,只 注射生理盐水的对侧耳蜗各部位无iNOS表达。图象分析表明: NaSA/m一、二组耳蜗iNOS阳性反应的平均灰度值明显高于 册组,经统计分析差异显著(单因素方差分析,P<o.05人即 NaSA/m一、二组耳蜗iNOS活性明显低于LPS组。 讨 论 鼓室内注射细菌LPS引起实验动物听力下降,伴有耳蜗iNOS 表达增强,提示NO可能参与炎症过程引起的耳蜗损伤;预先注射 NaSA后,由LPS引起的ABR反应阈上移程度有所减轻,同时iN- OS的表达亦减弱,证明NaSA对LPS引起的耳蜗损伤具有一定的 保护作用,这种保护作用可能与抑制iNOS的表达有关。 目前已知生物体内有三种亚型的NOS,即神经元型hNOSX 内皮型*NOS)和诱导型ONOSX其中前两型为结构型*NOS人 生理状态下即存在,催化少量的NO合成,参与神经传递、血流调 节和免疫反应等生理活动。iNOS一般情况下不表达,在受到 LPS、肿瘤坏死因子等因素刺激时开始表达,其活性是其他两种亚 型的千倍以上,能催化合成大量的NO,对细胞组织产生毒性作 用。 已有研究表明耳蜗中iNOS表达及其催化的过量NO合成对 耳蜗的听觉功能能产生抑制性影响。耳蜗在受到LPS、肿瘤坏死 因子刺激时可见iNOS表达,耳毒性药物如庆大霉素* 铂等也能 引起耳蜗iNOS表达,在噪声性聋的动物模型中也能见到耳蜗中 有 iNOS表达,而应用 NOS的抑制剂如 N一硝基一L一精氨酸队一 NNA人J一硝基一精氨酸甲酯等能减轻缺氧或耳毒性药物引起的 听功能减退,说明上述条件下耳蜗iNOS表达和NO合成参与了耳


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