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旋毛虫种株基因组DNA多态性研究

白丽娜  
【摘要】: 前言 旋毛形线虫[Trichinella spiralis Owen 1835(Rialliet,1895),简称旋毛虫]引起的旋毛虫病是一种人兽共患的寄生虫病,可在人及150多种哺乳动物间广泛传播。近年来,我国部分省区的旋毛虫感染有上升趋势,给人畜造成了严重危害。 有关旋毛虫种株的研究是进行各种深入研究的基本前提,一直是旋毛虫的研究热点。长期以来国内外有关旋毛虫的种株分类存在很大的争议。70年代以前,人们认为旋毛虫只有一个种:T.spiralis(Ts、T1)。1979年Boev提出旋毛虫有4个种:Ts、Tna(T.nativa、T2)、Tp(T.pseudospiralis、T4)、Tne(T.nelsoni、T7)。而Dick(1983)却认为Ts是唯一的种,Tna、Tne、Tp应视为三个亚种。随着分子生物学技术的发展,尤其是限制性片段长度多态性(RFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)的应用,至目前国外的种株研究工作进展明显,多认同将旋毛虫属分为7个种:T1、T2、T3(T.britovi、Tbr)、T4、T5(T. murrelli)、T7、T10(T. papuae)和3个分类地位尚未确定的基因型:T6、T8、T9。 近年来,国内很多学者通过同工酶分析、等电聚焦技术、扩增长度片断多态性(AFLP)和RFLP等研究,认为我国的猪体与犬体旋毛虫间存在明显差异,属于两个不同的种,因此,我国至少存在两种旋毛虫;但也有人持不同意见,认为二者间的亲缘关系较近,属同一种群。另外,在旋毛虫种株的分类与地理分布的关系等方面也存在着不同见地。 RAPD技术是Williams和Welsh于1990年创建的一项DNA多态性检测技术。它是利用碱基顺序随机排列的寡核苷酸(通常 为10聚体)为引物,对目的基因组DNA进行PCR随机扩增,由于 物种的不同,其基因组中与引物相匹配的碱基序列的空间位置和 数目都有可能不同,所以扩增产物的大小和数量也不同,通过对扩 增产物的琼脂糖凝胶电泳可以获得详细而精确的DNA指纹图谱, 再根据扩增产物的带型及强弱即可分析不同种株间的某些区域乃 至整个基因组DNA的差异性。要想了解基因组更多的遗传信息, 则需用尽可能多的引物进行随机扩增,这是RAPD技术的一个重 要特点。目前,国内应用RAPD技术进行旋毛虫研究的报道有3 篇,尽管应用的引物量不是很多(分别为*lj条X但为旋毛虫 种株研究奠定了良好的开端。 本实验采用较多的新的随机引物(包括单一引物和复合引 物人扩大被检测的基因组的范围,力求获得更多新的遗传信息, 进一步对国内J的旋毛虫种株间差异及虫种归属进行探讨,确定 宿主种类、地理分布对种株的影响。另外,进一步通过聚类分析确 定各种株之间的亲缘关系,以了解它们在进化过程中的分化情况, 为旋毛虫种株进一步的基因型鉴定和分类积累有意义的资料,同 时本实验也为旋毛虫病的检测、诊断及流行病研究提供了理论依 据。 实验方法 采用8组单一引物和12组复合引物分别对我国三株旋毛虫 (黑龙江五常犬、黑龙江海伦猪及河南新野猪)和两个国际标准虫 种 [ TI(波兰家猪八TZ(挪威北极熊门的基因组 DNA进行随机扩 增,扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳分离FB染色,在GDS8000 凝胶分析仪上照相。根据分子量标记的迁移率,应用Gelwrk门D Intermediate软件计算各扩增DNA片段的长度K人并依照RAPD 技术现行的统计方法进行数据分析,根据Net’s等的公式:SI= ·2· ZNw八 Nx+N*计算出随机扩增多态性 DNA片段的共享度(也称 遗传相似指数人根据遗传相似指数,用SPSS10.0统计分析软件 对各种株间的亲缘关系进行聚类分析。 实验结果 1.单一引物对旋毛虫基因组DNA扩增反应的结果: 弓物 P-01、P-03、P-04、P-05、P-06分别在 6次重复扩 增中产生稳定的扩增带型,共得到5组清晰且重复性较好的DNA 指纹图谱。 弓物 P-01、P-03、P-04、P-06既得到了犬株与猪株旋毛 虫的种间共有片段,又得到黑龙江犬株与国际标准虫种h,河南 猪株、黑龙江猪株与国际标准虫种TI的种内共有片段。引物P- 05仅得到种内共有片段。 引物P-03丁一04、P-06的扩增图谱显示,黑龙江猪株、河 南猪株与0,黑龙江犬株与h所获的扩增带的数量和位置相同。 引物P-01的扩增图谱表明黑龙江大株与D的指纹图谱不完全 一致,黑龙江猪株、河南猪株与D的指纹图谱一致。引物P-05 的扩增图谱显示黑龙江猪株与河南猪株的指纹图谱存在差异,而 河南猪株和n的扩增图谱、黑龙江犬株和h的扩增图谱完全一 致。 2.复合引物对旋毛虫基因组DNA扩增反应的结果: 将单一引物两两组合,其中N二一P02、P03-P04、P05-P06。 poZ-P06分别在6次重复试验中产生了重复性较好的DNA指纹 图谱。 以上4种复合引物均既获得犬株旋毛虫与猪株旋毛虫的种间 共有片段,又得到黑龙江犬株与h、河南猪株和黑龙江猪株与血 的种内共有片段。引物P03-P04、P05-r所得的DNA指纹图 ·3· 谱显示黑龙江犬株与TI的DNA指纹图谱一致,黑龙江猪株、河南


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