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氨对肝硬化大鼠模型脑神经细胞凋亡的影响

刘洪艳  
【摘要】: 目的 氨是引起肝性脑病(HE)的一种主要的异常代谢产物,高血氨是目前公认的肝性脑病发病的一个重要的因素,有学者报告一些肝性脑病病人的脑CT可见明显的大脑皮质萎缩,病理学检查可见大脑或小脑神经元消失,但其发生的病理学基础尚不清楚,目前已有实验证明氨可以引起体外培养胚胎大鼠脑皮质神经细胞凋亡。本研究拟应用肝硬化动物模型,给予氨负荷来研究氨对脑神经细胞凋亡的影响。 材料与方法 实验动物为健康雄性Wistar大鼠,根据4种不同处理方法将大鼠随机分成4组:正常对照组:不加外界干预因素;正常氨负荷对照组:实验末给予氨负荷;实验对照组:应用四氯化碳制备肝硬化模型,不加外界干预因素;实验组:制备肝硬化模型,实验末给予氨负荷。各组大鼠在给予氨负荷前及20分钟后分别经内眦静脉应用抗凝管采血并在半小时内应用vitros AMON干片比色法测定血氨值。给药后2小时内观察大鼠的状态,应用角膜反射及翻转反射的存在与否判断是否伴有肝性脑病的发生。2小时后处死大鼠,处死前经心脏采血检测谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)和总胆红素(TBil)。处死后立即取大脑及肝右叶组织,应用4%多聚甲醛固定。常规染色显微镜观察肝脏组织的改变,以确定肝硬化模型是否形成;镜下观察脑组织的形态改变,并应用末端脱氧核苷酸转移酶介导的末端标记(TUNEL)法对石蜡包埋的脑组织进行脑细胞凋亡的检测。DAB显色后,细胞核呈深棕黄色染色的为凋亡细胞,于显微镜下计数凋亡指数(AI)。 结 果 二.实验组中有3只大鼠角膜反射与翻转反射消失,证明出现 肝性脑病;正常对照组、正常氨负荷对照组及实验对照组角膜反射 与翻转反射存在,均未出现肝性脑病。实验对照组有5只生成腹 水,实验组有6只生成腹水。显微镜下观察:实验组及实验对照组 肝小叶结构破坏,纤维组织增生,有明显硬化结节形成;正常对照 组及正常氨负荷对照组肝脏结构正常;实验组与各对照组脑组织 均未见异常。 2.分别比较实验对照组及实验组与正常对照组的ALT人ST。 TBil及0分血氨水平,具有显著性差异,说明动物模型组存在肝功 能改变,血氨水平也高于正常。实验组给予氨负荷后血氨值与正 常氨负荷组、实验对照组比较有明显增高,经检验具有非常显著性 差异河<0.01人实验对照组脑细胞周与正常对照组比较具有 显著性差异瞩<0.05X实验组脑细胞周与实验对照组及正常氨 负荷对照组比较具有非常显著性差异(P<o.01入其中发生*E 的大鼠脑细胞AI都大于均数。 讨 论 肝性脑病是肝硬化晚期常见的严重并发症,它的发病机理目 前尚未完全清楚,其中氨中毒理论是目前公认的发病机制之一。 肝硬化病人肝功能逐渐恶化,肝内外侧支循环的建立使来自肠道 的氨绕过肝脏直接进入体循环,氨的生成增多而清除减少,使体内 氨水平逐渐升高,当氨进人脑组织时,可以干扰脑的能量代谢,影 响Na”-K“-ATP酶的活性,破坏血脑屏障的完整性,干扰神经 递质间的平衡。目前研究证实凋亡蛋白酶激活因子一1(Apaf一 问是一种诱导凋亡的因子,它有一个结合ATP的位点,氨由于能 够干扰脑的能量代谢,这可能是氨引起肝性脑病的一个作用机制。 ·2· 本研究应用大鼠肝硬化动物模型给予氨负荷后发现:肝硬化大鼠 血氨水平已高于正常,而且对氨负荷耐受性下降,给予氨负荷后, 血氨水平则更显著升高,再一次证实了氨在HE中的作用。 神经细胞的死亡有二种方式:坏死和凋亡,后者是一种更轻微 的J炎症的、依赖能量的细胞死亡方式。细胞凋亡是一种生理调 节机制,参与调节机体发育、细胞分化及体内正常的细胞更新,受 细胞内外因素的影响。近年来对细胞凋亡的分子机理研究显示, 细胞凋亡是一个遗传的程序性过程,是基因表达的结果,当细胞凋 亡相关基因的组成成分发生突变或出现数量异常时,此过程可受 到干扰,从而引起细胞增殖与死亡的平衡障碍,进而导致多种疾病 的发生。许多研究证实一些神经退行性疾病与神经细胞凋亡有 关:如早老性痴呆,帕金森氏症,脊柱肌肉萎缩,肌萎缩性侧索硬 化。 本研究通过TUNEL检测发现脑细胞在正常情况下末加任何 处理因素时,也可发生少量的细胞凋亡;实验对照组AI值与正常 对照组之间比较具有显著性差异,前者的血氨高于后者 瞩<0.01厂说明氨能够引起肝硬化大鼠模型脑细胞凋亡;在给予 氨负荷后,实验组与实验对照组相比,脑细胞凋亡指数有所增加, 实验组与正常给予氨负荷组比较,脑细胞凋亡指数也明显增加,实 验组与以上比较的两组血氨水平存在明显差异,说明血氨越高,细 胞凋亡越明显。本实验不仅进一步证实氨是能够诱发HE的一个 因素,而且发现氨可以促进肝硬化大鼠脑细胞凋亡。实验组给予 氨负荷后发生肝性脑病的大鼠脑细胞凋亡指数都大于均数,说明 肝性脑病可能存在明显的脑细胞凋亡。从细胞凋亡调控的角度分 析,在氨浓度不断积累的过程中,有可能通过细胞受体第二信使的


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