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哮喘豚鼠MMP-9、TIMP-1的表达及与气道炎症及重塑的关系

许小扬  
【摘要】: 前言 基质金属蛋白酶(Metrix Metalloproteinases,MMPs)是一组钙、锌依赖的钛链内切酶家族,能够降解细胞外基质的多种成分,如:胶原、层粘连蛋白、蛋白多糖和弹性蛋白等。基质金属蛋白酶抑制剂(Tissue inhibitors of metalloproteinases,TIMPs)是其抑制剂,能够抑制MMPs,可能参与哮喘时细胞外基质的沉积。 支气管哮喘是由多种细胞参与的非特异性气道炎症。哮喘时炎症细胞穿透内皮及上皮基底膜,到达炎症部位,参与炎症反应。但是,单纯用气道炎症并不能完全解释支气管哮喘的所有病理改变。人们在支气管哮喘患者的尸检中发现,其气道壁结构发生了变化:气道壁、气道平滑肌明显增厚,即气道重塑。现在人们已认识到气道炎症和重塑是支气管哮喘的两大重要特征。气道平滑肌增生是气道重塑的重要表现,可引起气道高反应、增加气道阻力。已有研究表明,MMP-1、MMP-2参与哮喘时气道平滑肌重塑,但作为MMPs家族中主要成员的MMP-9及其抑制剂TIMP-1,是否参与哮喘时气道平滑肌重塑尚待研究。本研究的目的在于探讨哮喘时气道平滑肌及BALF中MMP-9、TIMP-1的表达及与气道重塑、气道炎症的关系。 实验材料 实验动物:豚鼠 实验仪器及试剂:卵蛋白,CW-Ⅰ型超声雾化器,Universal 32R离心机,Olympus-BX51显微照像系统,Metmorph/Cool Sn砌AX70显微图像分析系统,MMP-9、TIMP-l免疫组化试剂 会 实验方法 实验动物分组及哮喘模型的建立:豚鼠20只,雌雄不拘,体重 200-250克,分为哮喘组10只,用10%卵蛋白IInl腹腔注射致 敏,五周后用二%卵蛋白雾化吸人激发哮喘,隔日一次共12周;对 照组10只,腹腔注射生理盐水lml,1周后雾化吸人生理盐水,隔 日一次共12周。 取材和检测方法:各组豚鼠分别于末次激发后24h用1%戊 巴比妥钠腹腔麻醉下开胸,经右心室插管至肺动脉,用 0.lmol/L PBS液快速冲洗,用生理盐水灌洗一侧肺,每次sail,回收灌洗液, 共二次,用4%多聚甲醛200ml灌洗固定,取支气管肺组织,置于 4%多聚甲醛中保存,石蜡包埋,切片,片厚IO卜m。**u经双层 无菌纱布过滤,4℃下 1200转/分离心 10分钟分离细胞,离心沉淀 细胞涂片计数细胞总数及分数。在肺组织切片上选择切面完整。 带有软骨的气道测量气道基底膜周长和平滑肌面积。用气道壁平 滑肌面即基底膜周长作为气道面积比较不同个体及不同来源的 气道。用免疫组化和图像分析系统测定气道平滑肌MMP-9。 lMP叫的表达;用免疫组化和显微镜下计数BALF中MMP-9。 TIMP一二免疫阳性细胞百分数。两组间均数采用t检验。 实验结果 1.哮喘豚鼠肺组织病理改变:哮喘豚鼠可见气道平滑肌增 厚,管腔变窄,有时可见粘液栓阻塞,气道壁嗜酸性粒细胞数增加。 2.BALF中细胞总分数:哮喘组细胞总数 门。165.00) ·2· X 10’/Inl」及嗜酸性粒细胞分数百分比卜39.3。13.89)%」均较 对照组〔细胞总数:门94。133.3)X 10丫Inl,嗜酸性粒细胞分数百 分比(23.30。4.二3)啪」增高(1”<O.0互)。 3.气道平滑肌面积(Was/Ph m)的比较:哮喘组气道平滑肌面 积卜5.* 土2.28)卜m’/卜叫较对照组【(3.33。1.01)卜m’/卜叫 明显增厚u<o对门。 4.MMP-9JIMPJ免疫反应的变化:O)哮喘组及对照组 BALF中巨噬细胞、淋巴细胞人酸性粒细胞及中性粒细胞MMP- 9、TIMP一二均表达阳性;p)哮喘组BALF中MMP-9、TIMP一二 阳性细胞百分比四MMP一9:(86.5土3.光)啪;T互MP一二:(91.4上二. 7)助」均较对照组[MMP-9:(54 6。3.6)%;’I’IMP一二:(51.4。 6.41)骚」明显增高(P<0.01八门)哮喘组及对照组平滑肌上均. 可见MMP-9、TIMP-l阳性反应呈棕黄色颗粒状;哮喘组MMP- 9、gMP-1阳性反应[MMP—9平均灰度值:(107.42。9.85); TIMP-1平均灰度值:(97.13上 13.96)」较对照组【MMP-9平均 灰度值:(12.20。14.00);TI]NP-l平均灰度值:(12.90。3. 97)」明显增强(P<0.of);与才照组相 匕,哮喘组 MMP-9/TIMP -l比例失调(p<0.05)。 讨 论 一、MMP-9、TIMP-l与哮喘时气道炎症 支气管哮喘是气道炎症性疾病,有多种炎症细胞参与。本研 究显示哮喘组BALF细胞总数及嗜酸性粒细胞分数百分比较对照 组明显增强;BAry中MMP-9在哮喘组及对照组的巨噬细胞、嗜 酸性粒细胞、淋巴细胞以及中性粒细胞均表达阳性;且哮喘组 MMP-9免疫阳性细胞百分比较对照组增强。MMP-9具有降解 细胞外基质如IV型胶原的作用,而内皮及上皮基膜的主要成分是 ·3· IV型胶原。因而推测,哮喘时炎症细胞可能借助 MMP-9破坏内 皮及上皮基膜的作用从外周血循环到达炎症部位,从而参与炎症 反应。TIMP一二具有抑制MMP-9的作用。在本实验中,TIMP一 二在


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