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α-1B糖蛋白前体基因的克隆及特性分析

孙迪  
【摘要】: 前言 cDNA末端快速扩增(Rapid Amplification of cDNA Ends,RACE)技术是采用PCR方法,根据已知部分的cDNA序列设计引物,扩增5′和3′端cDNA,是克隆全长cDNA的主要辅助手段之一。与研究整个基因组相比更加简便和快捷,可以在短时间内获得大量信息,并且可以在低丰度的转录本中进行快速扩增;与传统的文库构建筛查法相比是一种简单而有效的基因克隆方法,已经成为基因组DNA研究不可替代的一种重要手段。随着人类基因组计划的完成,人类遗传密码开始揭密,目前人类所面临的主要任务是找出编码人类蛋白质的近三万个基因在染色体上的确切位置。基于这样的目标,RACE技术作为一种基因克隆的手段日益受到人们的重视,并对其进行了各种改良。本研究中在本课题组进行外显子捕获的基础上,利用RACE方法,从人肝Marathon cDNA文库中克隆一个免疫球蛋白超家族的新成员:α-1 B糖蛋白前体的完整cDNA,经GenBank查新证实为一新基因,登录号为AF414429。 实验材料 1.人肝Marathon-Ready cDNA文库 2.基因克隆相关分子生物学试剂 3.Northern杂交及RT-PCR相关试剂 4.各种胎儿组织标本 实验方法 根据外显子捕获系统所得的外显子序列设计5′基因特异性引物及3′基因特异性引物,以RACE方法在人肝Marathon cDNA文库中进行扩增,以获得对应的5′和3′cDNA片段;然后进行拼接 得到完整的CDNA。利用生物信息学手段对该CDNA进行阅读框 分析并推测其编码的蛋白质。然后进行enBank查新及Banklt 在线登录。根据所获得的 3’-RACE片段制备探针并设计引物, 进行Northern杂交和RT-PCR分析,探讨该基因在人多神组织中 的表达模式。 实验结果 5’-RACE扩增结果进行 1%琼脂糖凝胶电泳,得到约 450hP 的片段。3’-RACE扩增产物以 Afund皿作为分子量参照物电泳 后可见约 1.6kb的亮带。将5’一RACE和 3’一RACE扩增产物 纯化,连接到PMD-18载体上进行双向测序和引物步行测序,拼 接得到一条l.69kb的序列。利用NCBI提供的ORF进行开放阅 读框架的判定,从第43到第1530碱基为完整的可读框,其中第二 到第 sl碱基编码信号肽 GenBank数据库查新结果证实为一新基 因(GenBank登录号AF414429X可读框全长1482个碱基序列,编 码一种由495个氨基酸组成的蛋白质,在NCBI提供的Translated Blast Se。h进行同源性比较,证实该基因编码人 a刁 糖蛋白前 体。Northern杂交及RT-PCR分析显示该基因在人多种组织中 表达,但在胎儿肝组织中的表达占绝对优势。 讨 论 aJ 糖蛋白在正常成年人血清中的浓度为平均22吟dl。 它的完整氨基酸序列已由 Ishioka等人于 1986年通过氨基酸测序 而得知,但该蛋白质的核昔酸序列一直无人克隆,而且其生物学功 能及在人类疾病中发挥的作用至今仍不清楚。在本研究中,我们 利用RACE的方法成功地从人肝CDNA文库中鉴定出一编码人类 。-IB糖蛋白的完整C**A,并研究了其在多种组织中的表达情 况。该基因全长1694hp,其中阅读框为1482个核昔酸序列,编码 ·2· 的蛋白质由495个氨基酸组成。人类a-IB糖蛋白的结构域分 析表明它由一个信号肽区及四个C-2型免疫球蛋白样的结构域 组成,因此认为它是免疫球蛋白超家族的一个新成员。免疫球蛋 白超家族的成员很多;功能也各有不同,但大都在免疫调节,细胞 增殖过程中发挥作用,如白细胞功能相关抗原,血小板源性生长因 子受体,神经细胞粘附分子等。它们的共同之处是都具有免疫球 蛋白样结构域。免疫球蛋白结构域的特殊之处在于它可以以嗜同 性及嗜异性两种方式与其他结构域发生作用。因此我们推断。- IB糖蛋白可能通过它的4个IG结构域介导不同蛋白与蛋白之间 的相互作用,起一种桥连接的作用。。-IB糖蛋白的同源性分析 显示没有一个已知的基因与其相似性高到足以提供进化起源方面 的信息(通常相似性需达到60%以上人最近克隆一个大鼠肝再 生相关基因(基因库登录号:ATh36054入它在大鼠肝2月切除后 的0.5小时内表达增加,它编码的蛋白质有1个IG结构域,同人 类 a-IB糖蛋白的相似性达 45%,我们的 No砌。杂交及 RT- PCR分析结果表明。-IB糖蛋白基因多在有再生能力的组织中 表达,例如肝,肠,肺,肾等,尤其在肝脏中呈现最强的表达,这与肝 脏是一个具有最强再生能力的组织这一事实相附。另外还发现, 该基因在胎儿肝组织中的表达明显强于正常成年人肝组织,可能 由于胎儿期肝生长状态同肝切除后的肝再生有某些相似之处。基 于以上的同源性比较,我们推断。-二B糖蛋白可能是一种在细胞 增殖过程中起作用的蛋白,然而这些推断在以后的工作中均有待 于进一步证实。 J 结 我们根据外显子捕获得来的外显子核昔酸序列设计引物,采 用RACE方法,从人肝脏Marathon cDNA文库中克隆出编码人o -IB糖蛋白前体的完整CDNA对其进行了基因结构分析?


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