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绦虫基因组DNA随机扩增多态性研究

宋曼殳  
【摘要】: 前言 寄生人体的绦虫主要有猪带绦虫、牛带绦虫、棘球绦虫和微小膜壳绦虫。其中最常见的是猪、牛带绦虫,其成虫可引起肠绦虫病。虫卵被其中间宿主食入后在组织内发育为囊尾蚴。全国每年经屠宰而发现的囊尾蚴病猪有数百万头,造成了巨大的经济损失。此外,猪带绦虫虫卵引起的人体囊虫病,常导致中枢神经系统器质性损害,甚至死亡。绦、囊虫病已是当前研究的热点内容之一,其病原体的鉴定和分类是进行各种深入研究的基本前提。 传统的分类与检测方法有时会显出一定的局限性。依据绦虫虫体的形态特征来鉴别检测的传统方法虽简便易行,但必须依赖完整的孕节或头节。对患者进行驱虫治疗后,因孕节节片部分受损或从粪便中仅收集到未成熟节片等原因,都会给鉴别检测带来困难。近年来许多学者认为基因分析的方法更为可靠。这对某些形态上具有很强相似性的不同种的绦虫成虫的鉴别尤为重要。Rish和Gottstein等分别采用DNA杂交技术和PCR技术对猪、牛带绦虫进行了鉴别检测研究,虽可弥补形态学方法的不足,但仍存在制备特异性探针、设计特异引物的预备性工作较为复杂等问题。并且,这些方法仅能用于绦虫的虫种鉴定,无法判定虫种间的亲缘关系。 随机扩增多态性DNA(RAPD)技术是Williams和Welsh于1990年发展起来的一项DNA多态性检测技术。通过识别各基因组DNA的多态片段,达到鉴定、分型和鉴别检测的目的。RAPD技术除具有常规PCR的快速、安全、简便等优点外,由于其引物的通用性以及无需事先了解基因组序列,因而大大地缩短了研究周期,提高了研究效率。近年来,已见该技术用于某些细菌和寄生虫 的检测和分型研究,取得了令人满意的结果。但至今尚未见其应 用于带绦虫DNA多态性研究的报道。本实验欲应用MPD技术, 试从DNA水平为绦虫的分类、鉴定及猪、牛带绦虫的鉴别检测提 供理论依据。 实验方法 用单引物和复合引物分别对猪、牛带绦虫和微小膜壳绦虫的 基因组DNA进行扩增,扩增产物经1.2%的琼脂糖凝胶电泳分 离下B染色,在GDS8000凝胶分析仪上照相。根据分子量标记的 迁移率,应用 Gelworks Intermediate软件计算各扩增 DNA片段 的长度uX并依照RAPD技术现行的统计方法进行数据分析: ①以同种绦虫全部个体均出现的保守的种特异性扩增片段,即每 种绦虫特异的扩增图谱作为绦虫种的鉴别标志;②根据Net8等 的公式:SI=ZNw八 Nx+N*计算出随机扩增多态性 DNA片段的 共享度和两个体间的平均遗传距离指数门-SI人其中3I为X 个体和Y个体的遗传相似指数J、为X和Y两个个体共有的扩 增带扑x和N,分别为X和Y个体分别拥有的扩增带。根据遗传 距离指数,用 SAS 6.04中的无权重配对算术平均数法(UPGMA) 对虫体间的亲缘关系进行聚类分析。 实验结果 1.同种虫体不同发育阶段(六钩蝴、囊尾蝴、幼节、成节或孕 节)的RAPD扩增产物相同。 2.单一引物对绦虫基因组DNA扩增反应的结果: 本实验所用的10条单引物中,弓物P-01. P-03、P-05。 P-06在6次重复扩增中均可产生特定的扩增带型,共得到4组清 晰且重复性较好的DNA指纹图谱。 引物 P-ofJ-03J-06所得的 DNA指纹图谱仅见种间差 ·二· 异,未见明显的种内个体间多态性,只有引物P-05所得的图谱在 牛带绦虫之间表现出种内个体差异。 3.复合引物对绦虫基因组DNA扩增反应的结果: g钥I物P01-P02、pci-o6、poZ-P06、P03-o7、o6- P07和 poZ-P03均可产生重复性较好的 DNA指纹图谱,其余引 物组合未见理想的扩增产物。复合引物所得的DNA指纹图谱,共 得扩增片段151条,片段大小多在290-1978hp之间,只显示出带 绦虫的种间差异,未见明显的种内个体间差异。 4.依据绦虫的随机扩增DNA片段共享度和相互间的遗传距 离指数,用SAS6.04统计软件中的UPGMA法进行处理得到的聚 类结果为:各猪带绦虫和各牛带绦虫首先聚为一类,再与微小膜壳 绦虫聚为一类。 讨 论 1.RAPD标记的重复性和RAPD实验的优化 RAPD反应的重复性受多个因素影响,但我们发现当RAPD 的反应体系优化后,仪器、试剂·固定不变时,指纹图谱的带型波动 可得到控制。MPD对模板的质量要求不高,为提高效率,可以采 用一些简单快速的基因组DNA提取方法。本实验的DNA模板浓 度为L 5J2.sng/PI,引物浓度为二 PM,退火温度为 34T,循环 40 次时,扩增结果稳定、重复性好。 人应用RAPD技术鉴别检测绦虫的实用性 在应用rPD技术对绦虫进行鉴别检测的实验中,所筛选的 引物均产生了特异的扩增产物,所获的指纹图谱都具有很好的种 特异性;并且仅 2.5 "g/gl的基因组 DNA就可得到可重复的扩增 产物,具有很高的敏感性和较好的重复性,表明本结果在绦虫的鉴 别检测中有一定的应用价值。从采用不同方法保存的绦虫标本 中,除福尔马林浸泡标本外,均能提取出基因组DNA,且均可得到


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