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丁香酚对LPS处理大鼠肝微粒体细胞色素P450和b_5含量的影响

狄军艳  
【摘要】: 前言 滑面内质网中含有丰富的细胞色素,主要为细胞色素P450(CYP450)和细胞色素b_5,它们在外源脂溶性化合物的生物转化和部分内源性基质代谢(如胆汁酸形成、胆色素代谢、类固醇物质合成)过程中起重要作用。CYP450是50年代中期Williams和Klingeberg发现、60年代初木村(Omura)和佐藤(Sato)验证的一类b族细胞色素,由于还原型细胞色素与一氧化碳结合后在光谱的450nm处具有最高吸收峰,因而命名为CYP450以别与其它b族细胞色素,P是英文Peak(高峰)的缩写。现已明确CYP450实际上是一类具有不同分子量、不同生化和免疫学特征以及不同催化能力的血红素蛋白的总称,它们所主导的生物转化过程是一个复杂的连锁酶促反应过程,CYP450与滑面内质网的其它成员如NADPH-CYP450还原酶、细胞色素b_5、NADH-细胞色素b_5还原酶、磷脂等组成混合功能氧化酶(简称MFO)系统,此外尚须供应足量的NADPH和分子氧。CYP450在氧化活动和底物结合中的作用决定其在MFO系统中起决定性作用。 花生四烯酸一旦从膜磷脂中释放出来可被三个主要的酶系统氧化:环氧化酶、脂氧化酶和依赖于CYP450的单氧化酶途径。花生四烯酸代谢的三个酶在脑组织(包括下丘脑)、肝、肾、肺和其它一些组织中表达。这三个途径分别导致生成PGs、LTs、环氧基和羟基四烯酸。抑制花生四烯酸代谢的任何一个酶能使其更容易从其它途径代谢。环氧化酶代谢途径导致发热,这一点已被大量的研究结果所证实。一些学者报导脂氧化酶代谢途径不参与体温调节,依赖于CYP450的单氧化酶代谢途径有参与解热和控制发热 上限的作用。 细胞色素b。能与CYP450紧密结合形成1:1的蛋白质复合 物,诱导后者自旋状态由低到高的改变,并增加其与底物的亲和 力,从而增加其代谢活性。而且CYP450含量与细胞色素b。含量 的比值非常重要,CYP450的代谢活性随着比值的改变而改变。 CYP450在体温调节中的作用是其氧化代谢作用的一个体现。 细胞色素b。影响CYP450在体温调节中的作用也是因为其在 CYP450代谢过程中有重要作用。本项研究为了明确CYP450和 细胞色素b。在体温调节中的作用,向大鼠腹腔注射致热源及解热 药,观察大鼠体温变化的同时其CYP450和细胞色素b。含量的变 化。 材料与方法 (一)实验动物 实验动物为40只雌性Wistar大鼠,体重200-2209。其被集 体饲养在光线\温度和湿度都受控制的密闭小室内。动物饲养环 境为12八2小时明暗周期N800-2000为光照入室温为18- 25℃,相对湿度为K0土2)%。可自由得到食物和水,并且在给处 理因素前至少适应环境二周。 (二)给药方法 所用药物均经腹腔注射。对照组、LPS组、丁香酚组给药全部 在上午0900施行,LPS/丁香酚组腹腔注射LPS是在上午0900施 行而腹腔注射丁香酚是在上午1200施行。 (三)测温方法 用北京师范大学司南仪器厂生产的数字温度计测量大鼠的体 温,将传感器插人直肠6cm。0900-1900每小时测量一次。体温 值用平均值。标准差表示。 ·2· (四)测量肝微粒体CYP45D和细胞色素b。含量的方法 用改进的Omura和Sato方法测量注射后24 /J\时的肝微粒体 CYP450和细胞色素b。的含量。测量CYP450含量时样品管含匀 浆介质K.SInl入连二亚硫酸钠门.Zllil入微粒体N.3Inl入快速充 人CO门0秒)并混匀,对照管含匀浆介质N.SInlX连二亚硫酸钠 N.ZM人微粒体N.3M)并混匀。读出忙0一及490一处的光 密度值。测量细胞色素b。含量时样品管含匀浆介质K.sndX连 二亚硫酸钠①.ZInl人微粒体N.3Inl)并混匀,对照管含匀浆介质 N.7llil厂微粒体门.3」)并混匀。读出423urn及500urn处的光 密度值。然后用以下公式计算CYP450和细胞色素b。的含量值。 其中0.09和0.171分别为CYP450和b。的消光系数,稀释倍数 =7.0川.3=23,蛋白量为样品蛋白浓度其用双缩尿法测量。 、。-。、,、AA(450-490)urn、。。。、。, P450(nmoVmg)=千十于六云己产 X稀释倍数 一”一 一口”0**玉*蛋*景·”卜。·*一 AA(423、500 ) urn、。一一山, b。(nmol/mg)=千十于二云六于X稀释惜数 一〕、一一一一一一一一口/ 0 091蛋白量’”卜刁”*一 (五)实验仪器与试剂 高速离心机(型号:DuPont So。ISuPer T。;,转头号:SL- 50T)\超速离心 机(型号:OTD 55B SoNIUltracentriDge DuPont, 转头号:T647.5厂电动组织匀浆器(Heidolph DIAX900,Germa- ny)、超声波细胞粉碎机(UP 50H UltrachallProcessor,Germany)。 磁力搅拌机(DSHK-4型,温州市医疗电器厂入UV-260分光光 度计(日本岛津瞩himadzu)公司厂PH计(INOLA PHChVEto w’r’w,armanv入数字温度计(传感器为大鼠型,北京师范大学司 南仅器厂人电子天平OD 200-3,沈阳龙腾电子称量仪器有限公 司)、冰柜(一70℃)、冰柜(一20℃)。 LPS*多糖,大肠杆菌


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