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IL-10RA基因多态性与SLE发病及抗ds-DNA抗体相关关系的研究

栗霄立  
【摘要】: 前言 系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus,SLE)是一种经典的自身免疫性疾病,其特征表现为高γ球蛋白血症及多种自身抗体的形成(如ds—DNA抗体等),可在肾脏局部沉积导致狼疮肾(LN),是SLE的主要致死因素之一。目前,由于对SLE的确切发病机制还不十分清楚,故而缺乏有效的治疗手段。许多研究证实遗传、免疫调控、激素、环境等诸多因素参与了SLE及LN的发病,其中白介素—10(IL—10)及其受体(IL—10R)由于在炎症调控、自身抗体产生中具有的独特作用,而受到越来越多的关注。 就目前所知IL—10作为一种多能细胞因子,其最基本的功能是对炎症的限制及消除以及调节体液免疫和炎症反应的平衡,并参与了病理性自身抗体的形成过程。多个研究发现人体血清IL—10分泌水平具有遗传背景并与SLE的发病及某些临床表型(狼疮肾、急进性肾炎等)有关。但由于本病的多基因相关,大量遗传异质性存在及环境因素的影响,使该病表型复杂多变,所以各家有关IL—10的研究结论存在一定差异,可重复性较差,也不能完全解释某些现象,因此有关SLE发病与IL—10的确切关系目前仍无定论。考虑到IL—10的生物功能依赖于其受体的存在,曾有学者提出IL—10受体本身可能存在着异常并与小鼠狼疮发生有关。而全基因组范围内的狼疮易感基因筛选也发现11q23(为IL—10RA编码基因位置)与SLE易感性有关。 基于以上考虑,我们以SLE患者为研究对象,通过对中国沈阳地区汉族人群IL—10RA基因的测序,以发现有意义的多态性位点,从而利用PCR扩增产物的SSCP(单链构像多态性)分析,确定多态性位点的人群分布差异及与本病发生的关系。并应用 ELISA法测定患者样本中ds一DNA抗体滴度,观察其在不同基因 型中的出现频率。以期在分子水平明确IL一10RA基因异常与 SLE发病的相关关系,为本病的临床诊断及治疗提供理论基础。 实验材料 主要试剂和仪器:PCR反应体系和TaqDNA聚合酶购与凡- ch。有限公司;ELISA酶标板、小牛胸腺ds一DNA、酶标抗体由日 本顺天堂大学惠赠。高速低温离心机(美国Beckman公司); PE9600 PCR扩增仪(美国PerkinE玩er公司);酶标仪(Bio一Rad uSA);恒温水浴循环仪。引物由上海生工合成,测序由上海基康 公司完成。 实验方法 1.研究对象 按美国风湿病学会1982年诊断标准于我院住院患者中筛选 160例汉族SLE病人作为病例组,从同种族献血员中选取200名 健康成人作对照。 2.检测方法 受试对象静脉采集抗凝血,分离血浆及白细胞,提取总DNA。 随机取10例样本对IL一10RA片段进行PCR扩增,分别测序以确 定多态性位点。SSCP电泳确定不同基因型的电泳带型后,进行全 部样本的PCR扩增及SSCP分析。ELISA法测定病例组血浆dsD- NA抗体的滴度,确定其在不同基因型中的阳性率。 3.统计分析: 病例组及对照组IL一10RA各基因型分布频率的组间比较采 用犷检验,病例组各基因型中ds一DNA抗体阳性率的差异亦采 讨论 目前,有关SLE的遗传易感性已得到多个流行病学调查所证 实,其相关研究也已延伸至基因水平。通过对小鼠模型及人群样 本的易感基因筛查,现已知道多个遗传位点与狼疮的易感性及表 型有关,其中lq31一32为IL一10的基因编码区,11够3包含有IL 一10RA的编码区。而有关IL一10的研究已发现其多种生物活性 与狼疮有关,并且其启动子区的多态性影响IL一ro的分泌水平且 和S砚的某些表型相关。作为一种抗炎因子,高浓度的IL一ro在 SLE病人中似乎并未显现出其抗炎效果,相反却刺激了体液免疫 反应,促进病理性自身抗体的合成。考虑到IL一10的生物活性依 赖于IL一10/IL一loRA复合物的形成,其受体缺陷可能在狼疮发 病及表型中起到一定作用。目前由于人们对IL一ro受体的结构 及信号传导机制了解不多,故有关SLE发病与IL一roRA的关系 尚未见有人报道。 我们的研究首次发现,在lL一101认基因的第五内含子上存 在有意义的单核昔酸多态性位点,即SNP 8053C/T,其基因型有三 种:5053叮T、8053c/e、so53e/T。正常组中s053T/T的出现频率 为6.25%,病例组为16.7%,两者具有显著的统计学差异(p 0.005),而C/T杂和子在S比病人中亦有所增高(P0.05)。此 外,我们的研究还发现C/C纯和型的出现在病例组中显著少于健 康对照组(P0.0001)。这提示IL一10RA基因多态性与狼疮发 病具有某种关联。而在狼疮鼠( NzB x Nzw)Fl x NzB中,我们已 观察到IL一10RA基因异常可导致免疫细胞表面IL一10RA的低 水平表达,伴有多种自身抗体的产生和蛋白尿的出现。由此推测 人类IL一10RA的第五内含子极有可能参与了其表达调控过程, 并与狼疮的发病相关。 结论 1.首次发现IL一10以第5内含子的8053位点处存在三种 单核昔酸多态性,分别为8053T/T、8053e/e、so53e/T。 2.IL一10RA内含子5的基因多态性在狼疮病例组和正常组 中的分布频率不同。基因型8053T/T、8053C/T在狼疮病人中明 显增高。因此,IL一10RA是狼疮发病的易感基因。 3.狼疮病例组,基因型为8053T/T者血浆ds?


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