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人胃内因子的分离、纯化及放免试剂盒研制

初照成  
【摘要】: 前言 人内因子(intrinsic factor IF)是由胃粘膜的壁细胞分泌的一种糖蛋白。其有两个活性部位,在摄入维生素B_(12)吸收的过程中,IF通过其中一个活性部位与摄入的维生素B_(12)结合形成复合物,从而保护维生素B_(12)不被小肠内水解酶破坏。然后再通过另一个活性部位与远端回肠上皮细胞膜上的受体结合,从而使维生素B_(12)被吸收。众所周知A型萎缩性胃炎患者因胃IF缺乏可引起恶性贫血,但有关血清IF水平与胃粘膜功能状态的研究报道不多。为了探讨血清IF水平与胃粘膜功能状态的关系,本研究分离纯化了人胃IF,并制作了放免试剂盒,最后采用放射免疫分析方法测定正常人及胃病患者血清中IF的含量。 材料与方法 1 实验材料 正常人胃组织来自中国医科大学法医学院,雄性家兔(大耳白):两只,体重2kg,来自中国医科大学实验动物中心,血清标本来自青海省人民医院2000年10月至2001年8月住院患者,其中胃癌患者49例(术后2例),年龄32—86岁;胃溃疡患者22例,年龄22—67岁;萎缩性胃炎患者25例,年龄20—65岁,均经内镜或病理检查证实。所有患者于清晨空腹安静状态下采血,分离血清,于-20℃冻存。正常血清标本来自中国医科大学附属一院献血员,共40例,年龄20—49岁。 主要试药:DEAE-Sephadex A50、Sephadex G-75、CNBr Activa- t。d Seph删sc 4B(Ph。cia公司产品),Ac…咖de和伍s砒ylam- ide石DSu 公司产品X低分子量标准蛋白质(上海丽珠生物 有限公司产品X弗氏完全佐剂(本院免疫教研室提供入 Na”‘Iu 京原子能研究所X其它常规试剂为化学纯。 2实验方法 半冰冻条件下刮取胃粘膜,用滤纸吸干,称重,剪碎,于 0.01 pH7.0磷酸缓冲液中制匀浆,经过两次离心,制成粗提液。 取粗提液30ml加人用0.01M pH7.0磷酸缓冲液预平衡的 DEAE-SePhadex A50层析柱(3cm x 60cm),连续盐梯度洗脱, 280urn波长下测各管吸光度,绘制吸光度曲线,将各个蛋白峰分别 收集起来,经缩水透析后,于-20℃保存。 取上述第4峰透析液IInl加人已用0.01M pH7.0磷酸缓冲液 预平衡的 SePhadex GJS层析柱(Icm x 60cm),用上述缓冲液洗 脱,280run波长下测各管吸光度,绘制吸光度曲线,收集蛋白峰,经 缩水过夜后,于-20℃保存。 再取凝胶过滤层析第互峰浓缩液0.6rnl于偶联Vi风。的滇化 氰活化的 Sepharose 4B亲和层析柱(0.6cm x 20cm)上,4℃条件下 过夜,然后以高浓度盐酸肌梯度作为最后洗脱步骤洗脱,280urn波 长下测各管吸光度,绘制吸光度曲线,收集蛋白峰。经缩水透析 后,于一20℃保存。 各蛋白峰蛋白质浓度测定采用酚试剂法。其分子量估计采用 不连续SDS聚丙烯酚氨凝胶电泳法。 用部分纯化的IF兔疫家兔制备抗血清,以双向兔疫扩散法勿. 定抗体效价。纯化的 IF采用 lodosen法,用放射性‘’l标记。 最后采用放免方法测定各组血清IF水平,其数据值范围均以 X。Sk表示,统计学差异性检验采用t检验。 ·2· 结 果 胃粘膜匀浆经离子交换层析共分离出5个蛋白峰,其第4峰 经凝胶过滤层析的第二峰再经亲和层析共分离2个蛋白峰,第二 峰经皿S-PAGE显示为一条带,分子量约为66 00。 免疫家兔所得血清IF的抗体效价为二:32。 各组血清IF放免测定结果:对照组为1.0584。0.4636pg/ml; 胃癌组为 0.6784。0.2508 pgilnl;萎缩性胃炎组为 0.7040 L 0. 2220 pg/tnl;胃溃疡组为 0.9279。0.4898 pgllnl。胃癌组和萎缩性 胃炎组患者血清IF水平明显低于对照组h<0.ofh胃溃疡组与 对照组比较血清 IF水平无统计学差异h>0.05人胃癌组与萎缩 性胃炎组比较血清 IF水平无明显差异帅>0.05人 胃溃疡组与胃 癌组和萎缩性胃炎组比较差异不明显N.01<p<0.05人 讨 论 IF是摄人维生素B;。吸收所必需的辅因子,在体内其合成与 分泌受多种物质影响。由于IF的含量较低,分离比较困难使其在 临床方面的应用受到限制。为了探讨血清IF与胃粘膜功能状态 的关系,特别是在胃癌时的变化,本研究采用离子交换层析、凝胶 过滤层析和亲和层析相结合的方法,成功分离了人的胃IF,经不 连续SDS聚丙烯酚凝胶电泳显示为一条带,分子量大约为66 000。 对胃病患者血清IF水平测定结果表明胃癌组患者和萎缩性胃炎 组患者血清IF水平明显低于对照组,这可能是由于此两种疾病 时,患者胃粘膜损坏导致壁细胞大量减少,从而使IF的合成与分 泌减少引起的。众所周知,萎缩性胃炎是胃癌的癌前病变,二者血 清IF水平无统计学差异,因此该结果表明较低的血清IF水平很 ·3· 可能是胃癌的高危指标,对于血清IF水平较低的体检者应该进一 步做胃镜检查。在胃溃疡患者,血清IF水平与对照组比较无统计 学差异,可能是由于胃溃疡时同时伴有广泛的胃粘膜炎性增生使 壁细胞分泌IF的量增加,所以,尽管壁细胞数


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