细胞周期素E在骨肉瘤和骨巨细胞瘤中表达的实验研究

【摘要】： 前言 分子生物学研究表明，肿瘤的发生是一个涉及多基因事件的复杂过程。在这个过程中，细胞周期各阶段的调控因子均有不同程度的异常，尤其是G1期调控因子更易受累。细胞周期素E(cyclinE)是细胞周期G1期重要的调节因子。在许多人类肿瘤中，cyclinE过表达。cyclinE过表达是怎样导致肿瘤的发生仍不十分清楚。在细胞进入S期前，cyclinE与细胞周期素依赖性激酶2(CDK2)结合构成复合物，显示出短暂而强烈的酶活性，并使视网膜母细胞瘤蛋白(pRB)磷酸化：，释放转录因子E2F，启动DNA合成，即G1期CDKs／pRB／E2F路径。cyclinE既是E2F的调控因子，又是其作用底物，从而构成了一个自动调节环路，此环路对于细胞周期中G1→S期的转换是必需的。GengY等人证明，CDKs／pRB／E2F路径是多细胞生物在进化过程中将细胞外刺激信号和cyclinE活性联系起来的途径，进而通过cyclinE的表达控制细胞周期的进程。而该路径在几乎所有人类恶性肿瘤中都遭到破坏，因此cyclinE在恶性肿瘤细胞增殖中所起的作用是至关重要的。 国外学者在cyclinE的表达与肿瘤的组织分型及预后的关系方面作了大量研究。结果表明它在肿瘤的发生中起重要作用。cyclinE在骨肉瘤和骨巨细胞瘤中的表达，国内外文献均少见报道。本实验采用免疫组化方法检测cyclinE在骨肉瘤和骨巨细胞瘤中的表达，分析其在这两种肿瘤发生及发展中的作用，为骨肉瘤和骨巨细胞瘤分子水平的诊断治疗和预后估计提供实验依据。 实验材料 一、标本：实验材料来自中国医科大学附属第一临床学院病理 室1992年1月至2001年7月的石蜡标本，骨肉瘤26例、骨巨细 胞瘤34例、骨软骨瘤22例。所有标本均经常规HE染色，由三位 病理专家重新确诊。其中骨巨细胞瘤按 Jaffe分级 1级 15例，11 级15例，皿级4例。 二、试剂：鼠抗人CyClinE单克隆抗体。SP试剂盒一套。以上 试剂均购自福州迈新（Mdri叫生物技术公司。 实验方法 一、操作步骤： l、所有蜡块均做 5 pm厚连续切片，进行常规 HE染色。 2、免疫组化染色： 骨肉瘤、骨巨细胞瘤和骨软骨瘤石蜡切片常规二甲苯脱蜡；梯 度酒精水化；于柠檬酸缓冲液中高温K2－98℃）煮沸2分30秒以 修复抗原；3％Hp。作用 10分钟，以消除内源性过氧化物酶活性； 加 10％山羊血清，置于 37T温箱内 30分钟；加 cyclinE一抗置于 4℃冰箱内过夜；加生物素标记的二抗，置于37℃温箱内30分钟； 加 HRP标记的卵白素工作液，置于 37 T温箱内 30分钟；抗原恢复 后，于每步操作之后，用PBS洗5分钟，重复三次；DAB显色。用 已知cyclinE表达阳性的切片作为阳性对照，用PBS代替一抗，按 上述步骤平行操作染色作为阴性对照。 二、结果判定：用OLYMPUS生物显微镜观察染色切片，以细 胞核呈清晰棕色为阳性。高倍显微镜下观察10个视野，计数 100o个肿瘤细胞。按阳性细胞所占比例分级：阳性细胞数＜25％ 为（＋h阳性细胞数占 25％－50％为（＋十八阳性细胞数＞50％ 为（＋＋十八以细胞无棕色或与背景一致浅棕色为（刁。 三、统计学处理：对检测结果采用 X’检验进行统计学处理，检 验标准均取P＜O．05为显著性差异。 ·2· 实验结果 CyClinE阳性染色为棕色或棕黄色，呈弥漫性颗粒状，分布于 胞核和胞浆内，阳性细胞记数以胞核着色为准。 一／yclinE在骨肉瘤、骨巨细胞瘤和骨软骨瘤中的表达情况： CyClinE在 26例骨肉瘤标本中，12例呈阳性表达／ 例为阴性表 达，阳性表达率为46．15％。在34例骨巨细胞瘤中，15例呈阳性 表达，19例为阴性表达，阳性表达率为44．12％。在22骨软骨瘤 中，呈例呈阳性表达，ZI例为阴性表达，阳性表达率为4．55％。统 计分析表明，cyclinE在骨肉瘤组的阳性表达率显著高于骨软骨瘤 组（P＜0刀5人在骨巨细胞瘤组中的阳性表达率显著高于骨软骨 瘤组（P＜o．05人而骨肉瘤和骨巨细胞瘤的阳性表达率之间无显 著性差异（P＞0．05）。 二上yclinE在骨巨细胞瘤各级中的表达情况：cyclinE在骨巨 细胞瘤基质细胞胞核及基质细胞和多核巨细胞胞浆中着色，未发 现多核巨细胞胞核着色。I级：15例中有 5例表达阳性问3． 33％八11级：15例中有8例表达阳性K3．33％八两者的阳性表 达率之间无显著性差异（P＞0．05入I级和H、皿K2．63％，19例 中有ic例表达阳性）级之间也无明显差异（P＞O．05人 讨 论 一／yclinE及其在肿瘤中的表达：cyclinE由 395个氨基酸组 成，编码cyclinE的基因定位于染色体19y12。cyclinE在众多人类 肿瘤中异常表达，如胃癌厚腺癌、肺癌等。目前，国内外有关Cy－ dnE在骨肿瘤中表达情况的报道较少。在大多数肿瘤的研究中， 用免疫标记的方法确认cyclinE在核内表达，但胞浆染色被观察到 的越来越多，本实验在三种肿瘤中均发现了胞浆染色。虽然Cy clinE蛋白在胞浆内合成和降解，通常情况下快速转运至核内发挥