糖尿病大鼠肺病变及P38 MAPK、NF-κB的作用

【摘要】： 目的 糖尿病血管病变是糖尿病慢性并发症的主要表现，其发生与一些生长因子及血管活性因子密切相关，其发生机制十分复杂，过去对高糖诱导的蛋白质非酶糖基化、多元醇通路异常，二酰基甘油—蛋白激酶C(PKC)通路研究较多，随着分子生物学及其技术的发展，有关细胞信号转导的研究成为最活跃的领域之一。丝裂原激活的蛋白激酶P38(P38MAPK)激活可能成为参于糖尿病血管并发症发生发展的重要因素。同时，近年来的研究表明，核转录因子(NF-κB)在糖尿病及其并发症发生发展中起重要作用。本实验观察了糖尿病大鼠肺组织及其微血管的组织病理学改变；观察了Ⅳ型胶原酶(MMP2、MMP9)及转化生长因子β1(TGF-β1)的表达及细胞信号转导系统重要酶类—PKC、P38MAPK，NF-κB活性的变化，为‘糖尿病肺’研究提供实验依据。 方法 1．动物分组及模型制备：150-170g雄性SD大鼠36只，单笼饲养，随机分为正常对照组(18只)、DM组(18只)。DM组大鼠腹腔内注射链脲佐菌素(STZ)60mg／kg，2天后血糖≥16.7mmol／L的为DM大鼠，正常对照组注射等量生理盐水，各组动物饲养1个月。部分动物处死后速取肺脏，左肺取小组织块迅速送入冰箱(-70℃)备测生化指标及1mm直径组织块2.5％戊二醛固定。另一部分动物经4％多聚甲醛灌注后取肺 组织，用4%多聚甲醛/0 .1%的DEPC溶液固定，48一72h后逐级脱水，常 温石蜡包埋，备做免疫组化染色及原位杂交。 2.特殊染色及HE常规染色及透射电镜观察 网状纤维染色采用Gomori渡银染色方法 胶原纤维染色采用weigert·5 resorein一fuehsin染色法 3.肺组织PKC活性的测定 PKC活性的测定采用改良的Takay法。肺组织溶于粉碎缓冲液，超 声粉碎(50次/管)，取上清加ATP反应液，30OC保温8分钟，取25 pL 点在what一manP81强阳离子交换滤纸上，加入75mmol/L磷酸溶液终止 反应，反复洗三次后晾干，放入预装有sml闪烁液的液闪瓶中，液体闪 烁仪(美国Beckmanlsol型)测定cpm数。 4.免疫组化方法检测MMPZ、MMPg、NF一B、TGF一pl 免疫组化染色一抗为免抗鼠NF一KB、MMPZ、MMpg、TGF一pl， 抗体工作浓度为1:100。二抗为羊抗兔，按SABC免疫组化试剂盒说明 书操作，DAB显色，苏木素复染。梯度脱水，二甲苯透明，中性树脂 封片，细胞胞浆，胞膜出现棕黄色或黄色者为阳性细胞。每组随机选10 只大鼠组织切片，采用图像分析软件(Luzex型图像分析仪)随机取高 倍视野(含小支气管)，筛选棕黄色颗粒细胞，镜下计数阳性细胞数， 测定平均灰度值。 5.P38MAPK检测 原位杂交检测P38MAPK操作按检测试剂盒说明书进行。采用ATP P3 8 MAPK的寡核普酸探针，经地高辛标记，针对大鼠P38 MAPK的寡 核昔酸探针序列为5’一GTGTG CCGAG CCAGT CCAAA ATCCA GAATC 一3，，P38MAPK mRNA的颗粒在细胞浆着色呈棕黄色。每组随机选6只 大鼠组织切片，采用图像分析软件(Luzex型图像分析仪)随机取高倍 视野(含小血管)筛选棕黄色颗粒细胞，镜下计数阳性细胞数，测定 mRNA的相对含量。 6.蛋白质免疫印迹分析NF一KB，TGF一pl水平 按蛋白质从SDS聚丙烯酞胺凝胶转移至固相支持体的免疫学测定 方法进行(1)。取正常及实验组肺组织提取蛋白，用SDS聚丙烯酞胺电 泳(SDS一队GE)分离，转移至固相支持体—硝酸纤维滤膜上，分 别按程序加入NF一KB、TGF一pl一抗及二抗，滴加发光剂，摄X光片。 应用ehenxmage:5500 vZ.o3分析软件对Westem带灰度值进行分析。 7.统计学处理方法 实验数据处理结果以均值士标准差表示。数据分析采用统计程序软 件包(sPsslo.sforwindows)进行方差分析，应用student’st检验来判断 差异的统计学意义，p值小于0.05差异具有显著性。 结果 1.肺组织病理学变化。 DM大鼠肺组织成纤维细胞数量增加，肺泡间隔及毛细血管基底膜 增厚，胶原纤维在肺泡间隔、细支气管、小血管及肺泡上皮细胞胞浆内 明显增多，互相交织，着色较深，染成红色。 2，免疫组化结果 2.1 TGF一pl染色结果 正常组大鼠的气管粘膜上皮细胞、肺泡巨噬细胞及少数血管内皮细 胞可见弱的TGF一pl表达。TGF一Bl在DM大鼠肺组织表达明显增多， 表现在支气管粘膜上皮细胞，微血管内皮细胞、少量肺泡上皮细胞及一 些肺间质细胞，可见胞浆棕黄色颗粒。 2.2 MMPZ、MMPg染色结果 MMPZ及MMpg在正常组大鼠肺组织的支气管粘膜上皮细胞，肺 泡巨噬细胞及小血管内皮细胞均有表达，在DM组大鼠上述部位表达不 同程度减弱，以MMPg更为明显。 2.3 NF一KB染色结果 正常组大鼠气道上皮细胞、肺泡上皮细胞，间质细胞及少数血管内 皮细胞可见弱的NF一KB表达。DM大鼠NF一KB在肺组织上述部位表 达明显增多，表现在可见较多的胞核及胞浆棕黄色颗粒。 3.P38MAPKmRNA原位杂交结果 DM大鼠P38MAPK」11朋A主要存在于血管内皮细胞，定位于胞浆， 呈棕黄色颗粒，支气管粘膜上皮及少量间质细胞可见轻度表达。正常组 大鼠肺组织内仅偶见间质细胞胞浆着色，染色较浅。 4.同位