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单细胞凝胶电泳图像分析系统改进

曲龙  
【摘要】: 实验目的 鉴于目前彗星试验图像分析软件存在的种种问题与不足,如它对于分析结果无法进行必要的人为校正、对于高度损伤的细胞可能分析错误、程序鲁棒性较差、内部文档不足、不易操作等,本课题在Helma等人的宏程序基础上进行了改进,着重解决高度损伤细胞的分析不准确甚至完全错误的问题,同时增加手动校正功能,以尽可能保证试验结果的真实性、准确性,并完善了该宏的容错性能与内外部文档,提高其鲁棒性,使用户更易操作。 实验方法 在对图像分析错误的改进中,本研究采用了以梯度阈值为基础的综合性彗星头中心点确定方法,代替原来计算彗星头中心的固定阈值(80%)方法。本研究还增加了对分析错误的数据进行人为校正的功能,由操作者重新指定正确的彗星头中心,从而把错误数据纠正为正确数据,并入统计分析。在容错性能的改善上,本研究在所有可能被用户调用的宏过程的开始处均加入了错误检查和异常处理程序段,可以暂停程序执行并给出正确的操作方法说明。同时,本研究应用改进后软件进行标准彗星试验检测,以100μM过氧化氢染毒小鼠外周血单个核细胞,并经历0、10、20、40min不同时间的孵育,获得不同损伤级别的细胞,并以改进后的软件进行分析。比较改进前后的尾长、尾矩、尾DNA百分含量上的差异、改进前后分析正确率差异、以及改进后的软件以不同DNA损伤级别为截断值判定阳性结果的灵敏度、特异度、Youden指数、粗一致性、调整一致性、阳性预测值、阴性预测值、阳性似然比和阴性似然比。 实验结果 改进后的软件对于原软件分析错误的图像在大多数情况下都可以正 确分析,同时拥有了错误数据的人工校正功能,程序鲁棒性有所增强,更 加方便易用。对于0一2级损伤的彗星细胞来说,原软件与改进后的软件 在尾长、尾矩、尾DNA百分含量上的分析具有统计学非常显著意义,但 实际差别量不大,没有实际生物学意义;而对3一4级损伤的彗星细胞来 说,改进后的软件比原软件在统计学上更加接近真值,且实际差别量足够 大,同时具有统计学非常显著意义和生物学意义;改进后的软件对于1 级及1级以上彗星细胞的判定来说,灵敏度97.70%、特异度67.42%、 Youden指数0.“、粗一致性79.45%、调整一致性82.33%、阳性预测值 “.41%、阳性似然比3.00、阴性预测值97.80%、阴性似然比0.03;而改 进后的软件对于2级及2级以上彗星细胞的判定来说,灵敏度95.38%、 特异度89.89%、Youden指数0.85、粗一致性93.150/0、调整一致性 92.88%、 阳性预测值93.23%、阳性似然比9.43、阴性预测值93.02%、阴性似然比 0.05。 结论 彗星试验图像分析软件经改进后,分析准确性得到提高,程序鲁棒性 增强,而且易用性改善,并增加了由操作者进行必要校正的功能;所得分 析结果与人为指定的分析结果相比,并不同时存在统计学显著差异和生物 学显著差异,可作为真实可靠的彗星数据分析系统应用;改进后的系统在 拖尾细胞判定上具有很高灵敏度,可用于筛查试验项目;在2级及2级以 上损伤细胞的判定上同时具有较高的灵敏度和特异度,是实验室研究中的 优良指标。


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