收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

部分变性高效液相色谱法检测胃癌组织、血浆及腹腔冲洗液中基因突变的研究

鲁翀  
【摘要】: 目的 变性高效液相色谱(denaturing high performance liquid chromatography,DHPLC)技术是近年来发展起来的一项新技术,其检测DNA序列的变异的主要原理是:存在突变的靶序列与野生型序列经过变性和复性处理,能杂交形成不完全互补的异源双链DNA,其变性温度略低于能够完全互补的同源双链DNA,利用部分变性的温度条件下,异源双链与同源双链融解温度的差异使色谱固定相保留它们的能力有所不同,根据柱上的保留时间分辨异源双链与同源双链,从而识别变异型。现有的报道认为,DHPLC可以快速地自动检测单个或多个碱基的置换以及小的插入和缺失,较以往多种检测方法均更加敏感特异,而且可检测的片段大小范围更广,可直接检测未做特殊处理PCR扩增产物,价格至少比测序等检测突变方法低廉10倍,平均8分钟即可检测一个样本,更重要的是:基本实现自动化操作,从而可从大量样品中快速搜索出未知的变异型,节约人力、物力和时间。本研究通过应用该技术检测胃癌组织、血浆及腹腔冲洗液中相关基因突变,探讨了其在检测实体肿瘤体细胞突变中的一些应用特点,阐明所检测的相关基因在胃癌中表达的意义,拟建立一种快速、方便、准确地筛查胃癌组织、血浆及腹腔冲洗液中基因突变的新方法。目的:(1)探讨将胃癌组织标本中提取的DNA,通过PCR扩增后,不与野生型DNA混合,直接应用DHPLC检测是否可行;比较两种选择DHPLC检测温度的主要方法,探讨如何更好的选择检测温度;应用普通Taq酶扩增的PCR产物进行DHPLC检测时,如何避免杂质峰的干扰。(2)检测p53基因及新近发现的CHK2基因、ST7基因等抑癌基因在胃癌中的表达,并阐明其意义。(3)探讨胃癌患者血浆DNA中扩增目的片段的可行性,建立一种快速检测血浆及腹腔冲洗液中DNA突变的新方法。 方法 1标本采取:所有39例标本均来自2001年9月一2002年8月于中国 医科大学附属第一临床学院肿瘤科行胃癌手术者。分别取癌组织、正常粘 膜、血浆及腹腔冲洗液标本。 2 DNA提取:胃癌组织、正常粘膜及腹腔冲洗液沉渣中DNA的提取,应 用常规酚抓仿法;血浆标本中DNA提取步骤主要依照QIA别mp DNA Blood Midi Kit说明书。 3 PCR扩增:应用普通介q酶分别对所检测基因相应外显子进行扩增, 扩增后作变性复性处理以保证充分形成杂合双链,不做其他特殊处理。 4 DHPLC温度选取及检测:结合2种常用方法,选取适当检测温度。适 当调节B液浓度,保证检测峰出现时间适当。每例样本检测时,注意与相 应正常粘膜标本同时检测。胃癌组织DNA扩增后不加人野生型DNA直接 进行检测。 5测序验证:对DHPLC检测出的与正常粘膜相比呈现异常峰型者,重 新扩增50林护CR产物,经T么kara DNAFr咫卿entpur访傀石。n‘t ver 2.0纯化 后进行测序。 实验结果 1在检测胃癌组织体细胞基因突变中的应用 同时平行检测39例胃癌组织及其相应正常粘膜组织,共发现呈异常 DHP砚峰形者9例,应用DHPLC检测p53基因突变的突变率为21%(8/ 39)。分别应用目前常用的两种判断检测温度的方法进行了检测,一种是 使用St翻而记大学网页上提供的计算软件直接给出融解温度(方法1),另 一种是应用DHPI刀仪随机携带的Wavemake衅.1融解曲线,结合操作者使 用经验判断及摸索确定检测温度(方法2),两种方法提供的温度均能全部 检出上述9例异常峰型。使用方法2较方法1少检测了2个温度。分别对 峰型异常者重新进行检测,分别检测出峰型发生改变的最低温度和最高温 度,结合测序结果发现,单碱基改变的异常峰型可检出的温度范围最小为 2.4一3.5℃,平均2.97℃。杂质峰出现范围介于2.5一3.smin之间,基本不 随温度及B液的浓度梯度改变而改变,目的峰随温度增高和B液浓度的增 高而前移,可以通过改变B液的浓度梯度避免杂质峰的干扰。 2胃癌组织中抑癌基因p53、517及CHKZ突变的检测 8例户3基因突变分别位于外显子5、6、7、8,其中3例突变既往未见报 道。(参见European Bioinformaties Institute,EBI)。本研究中,P53基因在 肠型胃癌中突变率40%(6/l5)明显高于弥漫型胃癌8.33%(2/24)(p0. 01)。分别扩增CHKZ基因的2个外显子和S’I7基因的4个外显子,应用 DHPLC检测所有39例胃癌组织及相应正常粘膜标本,均未见异常峰型。 3胃癌病人血浆及腹腔冲洗液中户3基因突变检测 提取8例在胃癌组织标本检出户3基因突变的病人血浆中DNA,应用 与组织中检出突变所在的相应外显子引物进行扩增,其中4例可扩增出相 应目的片段,与正常粘膜扩增出的野生型片段及癌组织扩增出的突变片段 同时进行DHPLC检测,均未发现明.显异常峰型。对8例腹腔冲洗液沉渣进 行DNA提取,及对相应外显子进行扩增,全部扩增出目的片段,与正常粘膜 扩增出的野生型片段及癌组织扩增出的突变片段同时进行DHPLC检测,其 中一例出现异常峰型。经测序证实与原发胃癌组织中突变一致。 讨论 1 DHPLC工作原理决定了其在检测实体肿瘤标本的体细胞突变时,可 能受到一定的限制,因为实体肿瘤组织中非肿瘤细胞的含量多少不等,很难 保证杂和性异


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 王淑;王琼;;宫腔镜检查与子宫内膜癌细胞扩散相关性探讨[J];医药论坛杂志;2006年03期
2 陈仲波;I期宫内膜癌患者行宫腔镜检查会引起腹腔冲洗液阳性吗?[J];国外医学.妇产科学分册;2005年01期
3 王煜环;曹跃鹏;;FQ-RT-PCR检测胃癌腹腔冲洗液沉渣CK20 mRNA的临床意义[J];现代实用医学;2011年06期
4 华芩;;腹腔细胞学预测子宫内膜腺癌预后[J];国外医学.妇产科学分册;1990年06期
5 盛勇,张长乐,管伟宁;胃癌病人腹腔脱落癌细胞检出率的研究[J];中国实用外科杂志;2003年10期
6 孙刚;余佩武;钱锋;石彦;唐波;莫敖;于歌;;腹腔镜胃癌手术对腹腔冲洗液中可溶性ICAM-1、CD44v6表达的影响及其意义[J];解放军医学杂志;2009年04期
7 高庆玉;隋丽华;娄阁;李凌;王乃强;;卵巢癌腹水或腹腔冲洗液细胞染色体的诊断[J];黑龙江医药;1995年04期
8 潘晓玉;王言奎;车艳辞;瓮占平;王波;;检测腹水或腹腔冲洗液中Survivin mRNA预测卵巢癌微转移[J];实用妇产科杂志;2006年05期
9 刘伟;余佩武;安杰;张超;赵永亮;;腹腔冲洗液沉淀STAT3和CEA检测与胃癌腹膜微转移的研究[J];第三军医大学学报;2007年08期
10 高敏;蒋国庆;燕鑫;王文;安娜;高雨农;;子宫内膜癌85例临床分析[J];中国妇产科临床杂志;2008年01期
11 张颐;庞丽;;腹腔冲洗液细胞学阳性与附件或浆膜层累及对ⅢA期子宫内膜癌患者预后的影响[J];山东医药;2010年12期
12 于吉人,邬一军,付佩芬,吕可真,高原,谢海洋,郑树森;胃癌患者腹腔冲洗液癌胚抗原mRNA检测的临床意义[J];中华普通外科杂志;2004年12期
13 张贤坤;刘宏斌;苏琳;赵宏伟;;流式细胞术检测胃癌患者腹腔冲洗液游离癌细胞的变化[J];现代肿瘤医学;2009年12期
14 张培海;高颖花;;宫腔镜检查与子宫内膜癌腹腔冲洗液细胞学相关因素的临床研究[J];实用妇产科杂志;2010年09期
15 杨宁;王文秀;赫文;信涛;徐玉清;;免疫磁珠技术检测胃癌患者腹腔微小转移的研究[J];哈尔滨医科大学学报;2006年06期
16 赵丹懿;徐惠绵;关一夫;安丽文;;胃癌腹腔冲洗液多巴脱羧酶mRNA的检测[J];中国肿瘤临床;2008年02期
17 杨勇;黄允宁;杨世杰;苏刚;杜鹏;王炜;;CEAmRNA在胃癌腹腔冲洗液中的表达[J];宁夏医学杂志;2009年06期
18 许德国;王潍博;;检测老年胃癌患者腹腔灌洗液CK19、CEA mRNA的临床意义[J];中国老年学杂志;2009年17期
19 郝晓蕊;尚国爱;李润军;;持续恒温腹腔冲洗对急性重症胰腺炎术后患者肠痉挛的影响[J];护理学杂志;2010年08期
20 何玉;晋茂生;杜丹丽;王才智;;RASSF 1A基因在卵巢癌组织及腹腔冲洗液中甲基化的研究[J];蚌埠医学院学报;2011年01期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 王金玲;张莹;王芳;初小辉;李俊环;贾金生;庞杰;;饲料中鸡源性成分PCR-DHPLC检测技术的建立[A];动物检疫学分会2010年学术年会论文集[C];2010年
2 陈巍;胡伯年;傅燕萍;王伟;吴东平;;胃肠道癌肿腹腔冲洗液中检测端粒酶的临床价值[A];2005年浙江省肿瘤学术会议全国大肠癌转移与复发的诊治研讨会学术论文集[C];2005年
3 杨卓;龙美娟;王斐;陈倩;赵保健;郭野;张旭;崔巍;;酶切富集联合DHPLC优化检测外周血EGFR、K-RAS基因突变及其临床应用[A];中华医学会第九次全国检验医学学术会议暨中国医院协会临床检验管理专业委员会第六届全国临床检验实验室管理学术会议论文汇编[C];2011年
4 毛雄英;沈广宇;陈辉;;变性高效液相色谱(DHPLC)在寡核苷酸引物质量控制中的应用[A];中国的遗传学研究——中国遗传学会第七次代表大会暨学术讨论会论文摘要汇编[C];2003年
5 杨静芳;陈彪;;中国人肝豆状核变性基因第8号外显子突变分布及应用变性高效液相色谱(DHPLC)技术快速检测[A];中华医学会第七次全国神经病学学术会议论文汇编[C];2004年
6 徐惠绵;王振宁;王剑峰;严哲弦;张建军;吴涛;;胃癌腹膜亚临床转移相关标志物检测及临床意义的研究[A];中国临床肿瘤学教育专辑(2002)——中国抗癌协会第六届临床肿瘤协作中心(CSCO)学术年会论文集[C];2002年
7 王翀;陈瑶生;李重生;黄志宏;田兴国;;DHPLC对猪肌肉组织差异表达EST的鉴定[A];中国畜牧兽医学会2004学术年会暨第五届全国畜牧兽医青年科技工作者学术研讨会论文集(上册)[C];2004年
8 陈巍;胡伯年;傅燕萍;王伟;吴东平;;胃肠道癌肿腹腔冲洗液端粒酶检测的临床意义[A];2005年浙江省肿瘤外科学术会议论文汇编[C];2005年
9 王利华;黄叶青;商璇;苏全喜;熊符;余青云;林慧萍;危智盛;洪铭范;徐湘民;;基于DHPLC技术的中国南方人群肝豆状核变性的突变分析[A];中国的遗传学研究——遗传学进步推动中国西部经济与社会发展——2011年中国遗传学会大会论文摘要汇编[C];2011年
10 沈广宇;毛雄英;陈辉;;DHPLC检测乙型肝炎病毒YMDD突变的方法学初探[A];中国的遗传学研究——中国遗传学会第七次代表大会暨学术讨论会论文摘要汇编[C];2003年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 鲁翀;部分变性高效液相色谱法检测胃癌组织、血浆及腹腔冲洗液中基因突变的研究[D];中国医科大学;2003年
2 张昊;应用Real-time RT-PCR进行胃癌腹膜亚临床转移相关标志物的检测[D];中国医科大学;2009年
3 王辉;溶血磷脂酸上调CXCL12-CXCR4生物轴与卵巢上皮性癌腹腔转移关系的研究[D];河北医科大学;2007年
4 王耀;肉制品和乳制品中致病菌检测技术体系建立及李氏菌分型鉴定与溯源研究[D];沈阳农业大学;2011年
5 赵丹懿;胃癌腹膜转移相关标志物的初步筛选及其功能研究[D];中国医科大学;2007年
6 覃春容;特发性卵巢早衰与TGFBR3基因多态性的相关性研究[D];南方医科大学;2011年
7 许东哲;胃癌腹腔游离癌细胞中RegIVmRNA和CEAmRNA表达及意义[D];延边大学;2008年
8 刘伟;STAT3在胃癌腹膜种植转移中的作用及机理研究[D];第三军医大学;2007年
9 汪斌超;DHPLC分析肺癌患者Rb2/p130、p53基因突变及其临床意义[D];中国协和医科大学;2001年
10 郭秀海;周期性麻痹的临床及相关基因突变研究[D];中国人民解放军军医进修学院;2004年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 李坤;腹腔镜胃部手术前后腹腔冲洗液中腹腔脱落癌细胞MMP-7的相关研究[D];兰州大学;2011年
2 李倩;DHPLC技术应用于两种常见出生缺陷的突变分析[D];南方医科大学;2010年
3 许斐;MR及腹腔冲洗液CEA检测在胃癌诊治及预后评估中的作用[D];兰州大学;2011年
4 柳万忠;腹腔镜胃癌手术前后腹腔冲洗液HPA和SURVIVIN的相关研究[D];兰州大学;2012年
5 盛贤能;胃癌腹腔冲洗液细胞角蛋白19 mRNA的检测[D];兰州大学;2010年
6 刘振芳;胃癌术中腹腔冲洗液CK20mRNA、COX-2 mRNA联合检测意义的研究[D];兰州大学;2010年
7 敖雪;研究应用DHPLC技术筛查ANPEP基因单核苷酸多态性[D];中国医科大学;2004年
8 高颖花;宫腔镜检查与子宫内膜癌腹腔冲洗液细胞学相关性的临床研究[D];山东大学;2009年
9 王利华;基于DHPLC技术的中国南方人群肝豆状核变性的突变分析[D];南方医科大学;2011年
10 张贤坤;流式细胞术检测胃癌手术前后腹腔冲洗液CEA的变化及意义[D];兰州大学;2009年
中国重要报纸全文数据库 前6条
1 河北小人民医院 张旭东;易伤肝肾的中草药[N];健康报;2001年
2 李忠;腹胀腹痛是何因 心电图下见分明[N];农村医药报(汉);2006年
3 杨安生;口眼歪斜早治疗[N];大众卫生报;2003年
4 王坚坚;蛋黄卵磷脂优于大豆卵磷脂[N];中国乡镇企业报;2002年
5 本报记者 慕欣;控制癌性腹水:腹腔化疗疗效可期[N];医药经济报;2010年
6 北京大学临床肿瘤学院胸部肿瘤内科主任 王洁;抽血即可明确肺癌基因分型[N];健康报;2011年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978