BMP7基因在心肌、脑缺血/再灌注中表达变化的实验研究

【摘要】： 前言 骨形态构建蛋白(BMPs)，也称成骨蛋白(OPs)、软骨衍生形态发生蛋白(CDMPs)、或生长及分化因子(GDFs)。BMPs属生长因子中转化生长因子β(TGF-β)超家族的一个亚群。BMPs的分离、纯化及分子克隆起源于去除矿物质的骨基质，并因其能诱导新骨及骨组织形成而得名。 BMP是通过大的前体蛋白合成的。所有BMP单体的中心结构是由C-端6个有固定空间间隔的胱氨酸残基组成的胱氨酸结组成。BMP可在同源性Arg-X-X-Arg位点处被蛋白水解为含羧基的成熟二聚体。根据BMP分子结构的相似性和差别，已分离出近30种BMP分子。 BMPs分布相当广泛，包括骨、心脏、脑及肾脏等器官。BMPs分泌后与细胞膜上具有丝氨酸-苏氨酸激酶活性的受体结合，受体Ⅱ型在结合部位使受体Ⅰ型磷酸化并激活其激酶活性，使转录因子Smad膜磷酸化后进入细胞核后，参与调节靶基因的转录。BMPs是多功能细胞因子，主要参与并调节细胞增殖和分化、调控细胞凋亡、组织和器官形态发生，参与组织修复等。 BMP7是近年来逐渐引起人们重视的一种BMP蛋白，早在原肠胚早期就开始在外胚层表面及脊索中，在将发育成前脑的神经上皮、发育成内脏的基质细胞和眼泡中、以及在心房和心室细胞中并在整个心脏发育过程中均可被检测到。 近来研究发现BMP7可以减少缺血对肾脏组织造成的损伤，与预防和治疗脑及其他重要器官缺血／再灌注损伤的关系密切，但机制相当复杂。有关这方面的研究正逐渐引起人们的重视。本实验建立了脑和心肌急性缺血／再灌注模型，通过逆转录PCR技术，Western印迹杂交技术等检测BMP7基因mRNA和BMP7蛋白在脑和心肌缺血／再灌注过程中表达的变化；同时 在心肌缺血/再灌注过程中应用目前临床常用的静脉麻醉药—异丙酚，观 察异丙酚在心肌缺血/再灌注损伤过程中对BM即基因表达的影响，从分子 生物学的角度观察和探讨异丙酚抗组织缺血/再灌注损伤的作用，为临床提 供实验依据。本实验包括二部分:一、骨形态构建蛋白7(BM刃)基因在大 鼠脑缺血/再灌注过程中表达变化的研究;二、异丙酚在大鼠心肌缺血才再灌 注过程中对BMP7基因表达影响的研究。 实验材料与方法 一、材料 1.实验动物:选取54只Wistar大鼠(体重在2009~30鲍之间)，由中 国医科大学动物实验中心提供。 2.主要试剂:戊巴比妥钠(上海化学试剂采购供应站购得);逆转录试 剂盒、PCR试剂盒及所需酶类均购自沈阳联星试剂公司。Westem blotting 所需羊多克隆抗体购自美国Santa Cru:公司。其他化学试剂均为国产分析 纯。 3.主要仪器:刃C一100型PCR扩增仪(美国);KODAKID型凝胶呈像 分析系统(美国);GIS一700D型数码凝胶扫描分析系统(上海);WFH一202 型紫外透射仪(日本);DYY一1113 IA型电泳仪(北京);JUNG一CM1800型 切片机(上海);OlymPus显微镜(日本);OlymPus AX70型显微摄像系统(日 本);Metam呷h/01ympus Dplo/BX51型显微图像分析系统(日本);Meta- mo甲h im卿system(美国UIC公司);SHH·WZI·C币00型电热恒温水浴 箱(北京，长安科学仪器厂);RM一6000多导生理检测仪(日本光电);D。 ponisT一21型低温离心机(美国);HEIDOLPH Dl尤妙oo型匀浆机(德国)o 二、方法 1.BMP7基因在大鼠脑缺血/再灌注过程中表达的改变:Wistar大鼠 24只随机分为2组:脑缺血/再灌注对照组(CC组，n=12)和脑缺血/再灌 注实验组(cI组，n=12)。cI组大鼠1%利多卡因局麻下暴露右侧颈总动 脉及颈内动脉和颈外动脉分叉处，分别结扎颈总动脉和颈外动脉，然后经分 叉处沿颈内动脉插人4一O，16~尼龙线，然后在插人点远端结扎并固定 尼龙线。这样尼龙线的远端可造成右侧大脑中动脉起始端和后交通支的阻 ·2· 塞，造成该动脉支配区域缺血。缺血.2小时后将尼龙线抽出，恢复动脉供 血。而对照组(CC组)仅施行动脉的暴露等假手术，并不造成缺血。大鼠 再灌注12小时后处死，取出脑组织置人液氮中保存。应用反转录一PCR和 Westem印迹杂交技术，观察脑组织BMP7mRNA和BMP7蛋白在缺血/再灌 注损伤过程中的表达变化。采用TT(:染色观察大鼠脑组织缺血/再灌注损 伤的情况。 2.异丙酚在大鼠心肌缺血/再灌注过程中对BM种基因表达影响的研 究:Wistar大鼠30只随机分成3组:组1为对照组(C组，n二10):大鼠经麻 醉后仅进行开胸手术;组2为缺血/再灌注组(I组，n=10):经左胸切口后 剪开心包，在距左冠状动脉根部3~‘处以3一O显微线可逆性阻断冠状动 脉血流造成急性缺血，10分钟后恢复心尖血供;C组和I组的大鼠以0.1血 ·kg一‘·min一‘的速度持续静脉滴注生理盐水。组3为异丙酚组(P组，n二 10):此组大鼠在开胸及心肌缺血的实验操作同组2，但在开胸和心肌缺血 过程中持续静脉输注1 mg·kg一‘·rr血一’异丙酚。所有大鼠术后2小时收 集血液标本2耐后处死，取出心尖部位组织置于液氮中保存。应用反转录 一PCR和Westem印迹杂交技术，观察心肌组织BMP7mRNA和BM脚蛋白 在缺血/再灌注损伤过程中的表达变化。检测各组血液标本中天冬氨酸转 氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸激酶(CK)含量变化。 结果 1.大鼠脑缺