WNK基因表达的研究

【摘要】： 前言 WNK激酶是一个新的蛋白激酶家族，是With no lysine kinase的缩写。该激酶家族成员在通常保守的位于激酶区域第二亚区的赖氨酸位点，赖氨酸被半胱氨酸所替代，但激酶的生物活性没有发生变化。而其它蛋白激酶此位点的改变通常会丧失激酶生物活性。高表达WNK激酶家族的一个成员——WNK1在HEK293细胞中，没有检测到已知的作用底物生物活性的变化，说明WNK激酶属于一个新的信号传导通路。 大鼠的WNK1基因是这个家族中第一个被克隆的基因。2001年，Wilson等克隆了此家族的另两个成员——人的WNK1和WNK4基因，分别位于12号和17号染色体，这两个基因是一种孟德尔遗传型高血压病的致病基因，致病突变分别是WNK1基因第一内含子的大片段缺失，导致患者白细胞的基因表达量提高5倍左右。WNK4基因突变是位于coiled-coil区域附近一段高度保守区域的错义突变。Northern印迹杂交表明WNK1广泛表达在人类、大鼠和小鼠的各个组织中，有两个转录子。而WNK4则主要在肾脏中表达。 Ⅱ型假性低醛固酮血症(pseudohypoaldosteronism type Ⅱ，PHAⅡ，OMIM #145260)，也被称为Gordon综合症。它以高血压，高血钾和代谢性酸中毒为主要临床表现，它是氯依赖性的，临床异常能够被钠-氯共转子NCCT的特异性拮抗剂——双氢克尿噻纠正，说明此疾病的发生和离子转运相关。 WNK激酶不同于其它蛋白激酶，它们的上游调控子和下游作用底物仍不清楚。免疫荧光表明WNK1激酶位于多种和氯离子内流相关的上皮中，表明它在多种组织中参与氯离子转运的调控。WNK4激酶是紧密复合物的一部分。实验表明野生型WNK4能够抑制NCCT对钠离子的摄入，而WNK1能够抑制这种负调控作用。说明WNK激酶和离子转运通道相作用，调控离子转运，与高血压病的发生相关。 本实验应用克隆、测序、Northern印迹杂交、原位杂交、体外翻译和免疫共沉淀技术，旨在研究WNK基因的表达情况及WNK4激酶的功能。 材料与方法 1.材料与试剂 人肾脏组织来源于医院交通创伤患者，小鼠肾脏组织来源于Bal b/c 小鼠。pGEM一T载体，感受态细菌JM109，反转录试剂盒和体外翻译试剂 盒均购自Promega公司。PcDNA3 .1载体，DH5a感受态细菌及PCR扩增试 剂购自Invitrogen公司。Bigdye购自ApPlied Biosystem公司。Northern印迹 杂交膜和eo一irrununopreeipitation kit购自Clonteeh公司。同位素购自Am- ersh二和NEN公司。质粒纯化及组织总RNA提取试剂盒购自QIAgen公 司。限制性内切酶购自Biolab公司。 2.克隆人WNK4全长cDNA到pGEM一T载体中 提取人肾脏总翻A，用位于WNK4 cDNA第7一27和3808一3833的序 列为上下游引物，用long template expanded PCR system扩增WNK4全长eD- NA，产物经纯化后连接到pGEM一T载体，转化感受态细菌，PCR筛查阳性 克隆，小量制备阳性质粒，酶切质粒，选取含有正确插人片段的质粒进行测 序反应，Navigator 4.0软件分析结果，对序列完全正确的质粒进行大量制 备，冻存备用。 3.WNK4基因全长的SNPs检测 设计引物，使PCR产物单一并覆盖基因全长，纯化扩增产物，进行测序 反应，用G50纯化产物，于3700型自动测序仪上测序，Navigator 4.0软件分 析结果，并进行统计学分析。 4.WNKI基因不同探针的Nori五二印迹杂交 PCR扩增人WNKI基因外显子l，4，5，10一15，以a，转录终止子下游 1.6kb一2.2kb片段，纯化产物，同位素标记探针，与人多种组织杂交，洗膜 后，曝光在X光片下，洗片并分析结果。 5.原位杂交 以小鼠肾脏总翩A为模板，扩增WNKI基因外显子1，24一28，以a片 段和WNK4基因外显子13一16片段，纯化后连接在pGEM一T载体上。筛 选阳性克隆，测序，大量制备序列完全正确的质粒。以这些质粒为模板， PCR扩增插人片段，纯化后标记同位素，与小鼠多组织杂交，确定探针特异 性。线性化质粒，分别用竹和SP6 RNA多聚酶，掺人3，s一dUTp，体外转录 正义和反义探针。检测探针的cPm值。对小鼠肾脏组织切片脱蜡，预杂 交，杂交，洗切片，脱水，曝光在X光片下，洗片分析结果，根据信号强弱决 定曝光时间。将切片浸人感光乳胶中曝光一定时间，然后洗切片，染色，置 于显微镜下观察结果。 6.构建表达载体 .构建带有e一Myc标签的syntenin表达载体.，构建带有HA标签的人 WNK4基因coiled一coilZ区域连同附近一个基序的表达载体。用含有限制 性酶切位点的上下游引物，以小鼠肾脏总RNA为模板，扩增syntenin基因 cDNA，酶切peDNA3 .1载体和扩增产物，纯化酶切产物，T4连接酶连接syn- tenin和载体，转化感受态细菌DHS。，PCR筛查阳性克隆，小量制备阳性质 粒，酶切质粒，对结果正确的质粒进行测序反应，分析测序结果，对正确的质 粒进行大量制备，冻存备用。以含有wNK4全长。DNA的pGEM一T载体 为模板，用含有HA标签及酶切位点的上下游引物进行PCR扩增，酶切 peDNA3 .1载体和扩增产物，其它同上。 7.体外翻译蛋白质 用TNT竹eoupled retieuloeyte lysate system kit体外翻译蛋白质，加人 l林g的syntenin一e一