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CyclinG2对体外培养细胞增殖的影响和相关机制的探索及其在胃癌组织中表达的研究

刘洁  
【摘要】: 前言 细胞周期调控的研究一直是细胞生物学和遗传学的热点和前沿领域,细胞周期准确而有序地进行是一切生命活动的基础。细胞周期蛋白(cyclin)是调节细胞周期活动的重要蛋白质,它们与细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin dependent kinase,CDK)共同形成的全酶复合体是细胞周期的正性驱动分子。细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子(cyclin dependent kinase inhibitors,CKI)可直接抑制相应的CDK活性或通过与cyclin竞争性结合CDK而起到抑制cyclin-CDK复合物的活性,从而作为负性调节因子参与细胞周期调控。Cyclin-CDK-CKI构成一个精确的网络系统共同调节细胞周期,从而达到一个动态的平衡,使细胞能够通过细胞周期进行正常的分裂繁殖。如果这种动力学平衡被破坏,细胞的正常生长就会受到影响,导致癌变或衰老死亡。 在哺乳动物细胞发现的12型细胞周期蛋白中均含有一段由100个左右氨基酸组成的保守区,称为周期蛋白盒(cyclin box),它是细胞周期蛋白的分子结构标志。G型蛋白是细胞周期蛋白家族中的新成员,它的分子结构与多数cyclin有所不同,其N端缺少降解所需的“destruction box”氨基酸序列,而C末端却包含有与表皮生长因子受体相似的自主磷酸化位点,这些表明它既是一种细胞周期蛋白,也是细胞内的信号传导分子。G型周期蛋白现已鉴定出两个成员-cyclinG1和cyclinG2,尽管它们在分子结构上高度同源,但在生物学功能上却存在着很大差别。关于cyclinG1的研究工作进行较早,它的生物学功能和作用机制已基本明确;而cyclinG2的克隆和鉴定较晚,它在细胞周期调控中究竟发挥何种作用还不十分明确。但现有的研究提示它可能作为负性调节因子参与细胞周期调控。 为进一步探讨cyclinG2基因对体外培养细胞增殖的影响,在本研究中我们首先通过阳离子介导的脂质体转染试剂将构建的pIRES-G2重组质粒和pIRESneo对照质粒分别转入人胃癌细胞系SGC-7901和人胚肾细胞系HEK-293细胞,观察cyclinG2基因对体外培养的正常和肿瘤细胞增殖 能力的影响,继而探讨其相关的作用机制。同时检测cyclinGZ蛋白在正常 胃组织及胃癌组织中的表达并分析其意义。 实验材料与方法 1.实验试剂 高糖DMEM、RPMll640和胎牛血清购自美国G山eo/BRL公司; DMEwF12(1:1)混合培养液购自美国Hyclone公司; 胰蛋白酶购自美国Si目叮a公司; HEPES由美国Amersco公司分装; 脂质体转染试剂(Upofectalnine Plus Reageni)和以18为美国玩vitrogen 公司产品; pIREsneo载体购自美国Cloneteeh公司; 质粒提取及纯化试剂盒购自德国Qiagen公司; Ultresensitive翎S一P免疫组织化学试剂盒;鼠单克隆抗体户3(DO一7) 蛋白(即用型);鼠单克隆抗体P21WAF,(即用型);DAB染色试剂盒均购自 福建迈新公司; 鼠单克隆抗体pZ IWA曰(浓缩型);辣根过氧化酶标记羊抗鼠二抗购自北 京中山公司; ECL试剂盒购自美国Santa Cruze公司; DC Protein assay试剂盒购自Bi。一Rad公司; SABC免疫组织化学试剂盒购自武汉博士德公司。 2.实验材料:人胃癌细胞系SGC一7901、人胚肾细胞系HEK一293由本 室所存。10例正常胃组织和40例胃癌石蜡标本取自中国医科大学第一临 床学院胃癌研究室。 3.实验方法: (l)通过阳离子介导的脂质体转染试剂将构建的pIRES一G2重组质粒 和pIRESneo对照质粒分别转人SGC一7901和陇K一293细胞,经一定浓度 的以18筛选抗性克隆,姬姆萨染色后观察并计数形成的细胞克隆。 (2)通过阳离子介导的脂质体转染试剂将构建的pIRES一G2重组质粒 和 PIRESne。对照质粒转人SGC一7901细胞,经一定浓度的G418(4的叫扩 而)筛选抗性克隆,挑取细胞克隆接种在24孔培养板中扩大培养,并通过 MTT(四甲基偶氮哇蓝)法检测转染不同质粒后细胞增殖能力的改变。 (3)将SGC一7901和IIEK一293细胞接种在铺有无菌盖片的六孔板 中,按照上述的方法同样进行转染,对转染后24、48和72小时的细胞盖片 进行夕1可坦免疫细胞化学染色,检测转染两种不同质粒后不同时间解1叭n 蛋白在细胞水平的改变。 (4)通过阳离子介导的脂质体转染试剂将构建的pIRES一G2重组质粒 和pIREsneo对照质粒转人SGC一7901和IIEK一293细胞,提取转染后24、 48和72小时的细胞总蛋白,进行解1 WAn蛋白的免疫印迹杂交,分析在不同 时间组转染两种不同质粒后户IWAFI蛋白在分子水平的改变。同时通过免 疫细胞化学染色检测两种细胞内源性户3的表达。 (5)对10例正常胃组织和40例胃癌组织石蜡标本进行cyclinGZ免疫 组织化学染色,观察cyclinGZ蛋白的表达并分析其意义。 实验结果 (l)倒置显微镜下观察并计数经G418筛选得到的稳定转染SGC- 7901细胞集落,pIREs一G2组形成的细胞集落数目减少,集落体积变小,集 落内的细胞形态变得不规则,胞质内出现大量的颗粒和空泡。pIRESneo组 形成的细胞集落数为87士3,pIRES一G2组形成的细胞集落数为53士4,占 对照组的60.1%,二者在统计学上差异显著(p0.01)。 (2)倒置显微镜下观察经G418筛选获得的?


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