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腰段连续硬膜外阻滞对大鼠妊高征的防治作用及机理的实验研究

董有静  
【摘要】: 前言 妊高征(PIH)是一种多发生于妊娠20周以后的以高血压、蛋白尿、水肿为特征的多脏器功能受损的综合征,在妊娠妇女中的发病率约为7-10%。关于其发病原因及病理变化学说颇多,但至今尚无定论。因而有关它的预防和治疗至今尚未找到满意的方法。妊高征是一种交感神经激活状态,妊高征的交感神经过度兴奋状态已被许多实验所证实,而这种状态可以降低机体的免疫力。在妊高征的病理生理过程中,交感神经系统放电加强,血管张力增高,分娩后趋于正常。现在的研究认为:妊娠是一种成功的半同种移植现象,其成功有赖于母-胎免疫平衡。妊高征的免疫发病机理在于母-胎免疫平衡失调。随着生殖免疫学的进展,它的免疫学发病机制的研究越来越得到重视。 目前,在妊高征的治疗上,产科临床以MgSO_4解痉为主,辅以降压、镇静、利尿和适时终止妊娠的综合方法,在临床症状和并发症的控制和治疗中效果并不十分满意。国外已有应用连续硬膜外阻滞治疗妊高征的报道并取得了较满意的临床效果,但缺乏详细的研究及治疗机制的阐明,以致于影响了该方法的广泛应用。在我科以往的研究中,张丽红已发现颈交感神经干离断对妊高征大鼠具有防治作用,说明从交感神经阻滞入手研究妊高征的治疗方法是完全有可能的。本实验首次通过对妊高征大鼠应用腰段连续硬膜外阻滞,探讨该方法对妊高征大鼠的防治作用及作用机制,为连续硬膜外阻滞应用于临床治疗妊高征提供基础实验和理论依据,使之成为临床防治妊高征的一种新的方法。 本研究分为三部分:一腰段连续硬膜外阻滞对妊高征大鼠的防治作用。二腰段连续硬膜外阻滞对PIH大鼠Fas/FasL系统及CD_4、CD_8淋巴细胞免疫功能的影响。三腰段连续硬膜外阻滞对妊高征大鼠IL-10、TNF-α的 影响。 实验材料与方法 一、实验材料 l实验动物 选用健康雌性Wister大鼠40只,体重230一3009(由中国医科大学附 属第二医院动物实验室提供),在室温18一28度,相对湿度40一70%的屏 障系统内饲养。 2主要仪器 RBp一1型鼠尾动脉测压仪,电子天平AA一250,杜邦咒1低温高速离 心机,UPZooH超声波粉碎机,HEIDOLPH DIA x 900匀浆机,5500一P紫外 线、可见光连续分光光谱仪,KodakID型凝胶成像分析系统,Biometra PCR 扩增仪,OLYMPUS B x60显微照像系统,Metalnorph显微图像分析系统, SUNRISE酶标仪。 3主要试剂 甲基左旋精氨酸甲醋(L一NAME),CD4、CDs免疫组化染色试剂盒, CD4、CD:RT一PCR试剂盒(TaKaRa),大鼠IL一10定量EIA试剂盒,TNF- a定量EIA试剂盒。 二、实验方法 1动物模型 参照Olson等介绍的方法,根据实际情况作一定的改进,复制妊高征大 鼠模型。孕鼠硬膜外腔置管并长期留置。麻醉:采用ro%水合氯醛(4mF kg)对大鼠进行腹腔注射,一般4一6分钟即昏睡倒下。手术过程:动物取俯 卧位,腰部垫一直径2.SCm的圆筒,四肢及头部固定于手术台上,将背部备 皮消毒后铺洞巾,摸清两侧骼棘,其连线为玩,在L:_2间隙处皮肤作一长约 Zcm纵行切口,切开该处背脊肌的筋膜,切断L,_2间的韧带,分离h脊突两 侧肌肉,大鼠脊柱尽量往前屈曲,用巾钳子夹住甄脊突往上提,用制备好的 无菌导管经黄韧带破口插人,方向向尾侧与脊柱纵轴平行,导管送人Zcm, 如无清亮的脑脊液外溢即为位于硬膜外间隙。导管固定皮下,造隧道至大 鼠颈背部皮肤穿出,接无菌封闭接头,固定,避免感染及大鼠咬噬。注药: 1%利多卡因20闷缓慢注人,大鼠马上出现双后肢及尾部麻痹,双前肢肌 力正常,为手术成功。其后按实验设计给药。 2试验动物分组:实验随机分四组,每组10只。 A.对照组:孕鼠从妊娠的第14天起每日皮下注射0.5耐生理盐水。 B.实验组:孕鼠从妊娠的第14天起每日皮下注射L一NAMESOmg (sam、spm各一次,每次25mg)。 C.假手术组:孕鼠从妊娠的第14天行硬膜外腔置管术,但不给药,余 同B组。 D.治疗组:孕鼠从妊娠的第14天行硬膜外腔置管术,每日注人0. x25% Bupivieain。25林l,sa饥/5 pm各一次,余同B组。 3观察指标及方法 孕鼠 l)体重、食量、尿量、人水量:于孕第13、20天将孕鼠置于代谢笼内,收 集尿液并测量体重、食量、尿量、人水量。 2)血压:从妊娠的第13天起,应用鼠尾动脉仪每日监测血压。 3)尿蛋白:以磺柳酸法测孕鼠第13、20天尿蛋白含量,将收集的24小 时尿液,以3000r/而n离心巧min取上清液送本院检验科即时检测,如隔日 检测,将样本放人O一8度冰箱待测。 4)硝酸还原酶法检测子宫、胎盘组织的一氧化氮(NO)含量。 胎盘及子宫 l)‘RT一PCR(逆转录一聚合酶链式反应)检测子宫、胎盘组织CD4 mR- NA、eD,mRNA的表达。 2)免疫组化方法检测CD4、CD,蛋白的表达。 3)原位杂交方法检测Fas mRNA、FasL mRNA的表达。 4)采用双抗体夹心ABC一EUSA法定量检测大鼠IL一10含量。 5)采用双抗体夹心ABC一EUSA法定量检测大鼠TNF一。含量。 结果 1腰段连续硬膜外阻滞对妊高征大鼠的作用: l)


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