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人类单纯性先天性心脏病遗传易感基因的定位与鉴定

邱广蓉  
【摘要】: 目的 先天性心脏病(Congenital Heart Disease,CHD)是一类严重危害婴幼儿健康的先天畸形,发病率占活产婴儿的4‰~50‰。其中,约有80%的CHD仅表现为心脏畸形,而不伴有其他系统的先天异常,称之为单纯性先天性心脏病(simple congenital heart disease)。目前认为,CHD主要是胚胎心脏发育异常所致,遗传因素在CHD的发病过程中发挥重要作用,遗传率(度)为55%~65%,但其遗传方式和外显率等均不清楚,故CHD致病基因研究进展缓慢。研究CHD的分子遗传学机制,不仅为阐明CHD的发生机理和遗传干预提供理论依据,同时对丰富人类基因组学的理论和实践应用,具有十分重要的意义,也为其他先天畸形的研究提供可借鉴的科学方法。 心脏的发育是一个极其复杂的过程。它涉及胚胎发育过程中不同时间、不同空间的若干个基因先后表达,也涉及细胞的迁移、分化、增生及精确的相互作用。国外学者应用荧光原位杂交、免疫组化、基因剔除等方法,通过对果蝇、琥珀鱼、鸡胚、鼠等心脏发育的研究,发现了一些与心脏发育相关的基因,如Nkx2-5、Pitx2、erbB2、MEF2C、dHAND、Endothelin、Irx4、Ufdl、NF-ATc、Sox-6。这些基因在进化过程中高度保守的特征为我们寻求CHD的相关基因提供了有利的线索。 目前国内外关于人类CHD的研究主要集中于孕早期环境因素和一些伴有心脏畸形的综合征,发现了引起心脏畸形的候选区域,如22q11、10p13、4p16,以及CHD相关基因如TBX5、Jagged-1、TFAP2B等。但在单纯性CHD的研究方面,仅Nkx2-5/Csx基因被证实与之有关。因此,国内外对人类单纯性CHD发病机理的研究尚待深入。 本课题组前期研究工作发现位于12q13区域内的D12S1056位点与单 纯性CHD显著相关(P0.01),提示在此位点附近可能存在单纯性CHD 遗传易感基因。为进一步证实,本研究在D12S1056位点附近选择10个微 卫星多态遗传标记:D12S1056、D12S1293、D12S83、D1251655、D1251662、 D125334、D125137、D125102、D1251702和D12S1691,对62个单纯性CHD 核心家系186位成员进行基因型分析和传递不平衡检验(Transmission Dise- 叫lib五uml’est,TDT),首次将单纯性eHD遗传易感基因定位至12q13区域 内3.4cM,井采用候选克隆策略,首次证明该候选区域内Gli基因与单纯性 CHD相关。 方法 标本:62个单纯性CHD核心家系共186名成员,其中VSD37人、ASD 8人、PDA功人、凡7人。62个单纯性CHD核心家系均由中国医科大学附 属第一临床学院、第二临床医院和沈阳军区陆军总院心脏外科提供。所有 患者均具有典型的临床表现,经心脏超声和手术确诊。取所有CHD患者及 其家系成员静脉血2而,构椽酸钠抗凝后一20“C冻存,备用。 1.微卫星多态位点的选择 根据各个微卫星多态位点的等位基因数目、杂合度及多态信息含量 (Polymo印hi‘:Inf’ormation Content,pIC)值,选择染色体12q13区域内10个微 卫星多态位点进行TDT检验。其中D1251056、D12S1293来自人类合作连 锁中心(The Cooperative Human Link鳃e Center,CHLC),DzZss3、D12S1655、 D12S一662、D125334、D125137、D12S102、D1251702、D12S一691选自基因组数 据库(Genome DataBase,GDB)。 2.基因型分析 常规饱和氯化钠盐析法提取外周血DNA。荧光标记PCR技术扩增微 卫星多态位点。酚/氯仿抽提法纯化PCR产物。经95“C变性3而n后,在 ABI PlllSMT“310型遗传分析仪上进行毛细管电泳。电泳介质为POP一4 胶,电泳条件为15Kv电泳24而n。Genescan Analysis 2.02软件自动分析基 因型。 3.TDT检验和遗传多态性分析 对62个核心家系成员进行TDT检验。对有意义的微卫星多态位点在 中国北方汉族人群中进行遗传多态性分析。采用直接计数法计算各微卫星 多态位点等位基因频率、基因型频率和杂合度。依据Hardy一Weinberg定 律计算各微卫星多态位点基因型频率和杂合度预期值,采用x,检验进行 Hardy一Weinbe铭平衡吻合度检验。 4.Gli基因与单纯性CHD相关性研究 在Gii基因编码区选择3个可引起氨基酸改变的cSNP:EI looQ、G933D 和G1012V。常规PCR扩增后,采用PCR一RFLP和DHPLC两种方法对62 个单纯性CHD核心家系进行基因型分析。其中,EI looQ和G933D两个 cSNP分别具有Ec0RI和Tfil酶切位点。应用wAvE⑧系统温度预测软件 对扩增片段序列进行分析,确定3个。SNP的熔解温度(Tm):G933 D Tm为 60.3OC,Ell00Q Tni为58.5”C,G1012VTm为61.3”C。PCR产物经缓慢变 性后进行DHPLC检测。3个csNP的不同基因型经测序证实。统计学分析 包括:应用在线Hardy一Weinberg检测程序分析基因型的Hardy一Weinberg 平衡吻合度;采用ETDT软件分别对Gli基因3个cSNP进行单位点关联分 析;应用ZLD软件进行配对连锁不平衡检验(连锁不平衡程度以D‘表示); 应用TRANSMrr version 2.5软件进行单倍型分析。 结果 1.毛细管电泳结果 Rllo经荧光扫描为蓝色,R6G经荧光扫描为绿色。单峰为纯合子,对 称双峰为杂合子。 2.基因型分析结果 62个核心家系在10个微卫星多态位点基?


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