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滨蒿内酯平喘作用机制的研究

柳春  
【摘要】: 目的 支气管哮喘是世界范围内严重危害人类健康的慢性疾病,其发病率和死亡率呈逐年上升趋势,因此,深入研究其发病机制、寻找选择性治疗支气管哮喘的特效药物是医药学界的重大课题。滨蒿内酯(Sco)是传统中药茵陈蒿或滨蒿中的有效成分之一,对气管平滑肌(TSM)具有强大的舒张作用,具有开发为有效平喘药物的潜力。本研究一方面对从沈阳地产滨蒿提取Sco的方法和收率进行考察;另一方面从Ryanodine受体介导内钙释放途径和Th1/Th2类因子失衡学说入手,在离体、在体及分子水平上对支气管哮喘机制进行研究,同时探讨Sco的平喘作用机制,为开发行之有效的平喘药物提供药理学依据。 方法 Sco的提取方法 取滨篙花穗或全草,阴干,剪碎(种子、果实直接用水或有机溶剂浸渍)40℃-80℃溶剂浸两次(4h、3h),浸出液合并,减压浓缩。浓缩液以氯仿萃取,氯仿萃取液浓缩到较小体积。先5%碳酸钠水溶液萃取除去羧基酸性成分,然后再以2%氢氧化钠水溶液萃取除去酚性成分。最后再以水洗,除去水分,回收氯仿至干。残渣以甲醇加热溶解,冷却,放置,析出白色针状结晶即为Sco,收集结晶,干燥,即得。 动物分组及处理因素 健康豚鼠,体重150-200g,雌雄各半(由辽宁中医学院实验动物中心提供)。随机分成生理盐水对照组(A组)、哮喘发作组(B组)和Sco治疗组(C组)。从实验第1天开始至第28天对C组每日雾化吸入0.034%Sco生理盐水溶液2分钟(该浓度为Sco的最大水溶剂量,哮喘抑制率为90%)。A、B两组以同样方式给予生理盐水。 哮喘豚鼠模型的建立 B组和C组:腹腔注射10%卵蛋白生理盐水溶液1ml致敏,2周后每日一次,每次2分钟,给予1%卵蛋白生理盐水超声雾化吸入以诱发哮喘,共两周。喷雾时观察豚鼠反应,以出现抖动,节律性点 头呼吸,呼吸频率加深加快,腹肌抽搐等为阳性反应,提示造模成功。激发 不成功或过敏性休克死亡者淘汰。A组除用生理盐水代替卵蛋白生理盐水 外,其余操作均与B、C组相同。末次激发结束后24小时内取材。 离体豚鼠气管环制备及张力测定棒击法处死豚鼠后迅速开胸,取出 其主气管置于冷的通有混合气体(95%0:,5%CO:)的Krebs一Henseleit(K- H)营养液中,剪除气管周围的结缔组织及脂肪组织,将其剪成3一~左右 的气管环,悬挂于盛有10祖K一H液的浴管中,保持温度37土0.5℃,并持续 通人混合气体。气管环的张力变化可通过其上端相连的力一位移换能器记 录在台式平衡记录仪上。标本初始负荷为29,每20而n换一次营养液,平 衡Zh后向浴管中加人试验药物。在每次试验开始时,重复应用60mM KCI 溶液直至获得稳定的收缩反应方可进行试验。 RT一PCR方法对豚鼠巧MC上殉R亚型的鉴定棒击法处死豚鼠后在 无菌条件下迅速开胸,取出完整肺组织,剥离主气管并分离其外周结缔组织 及脂肪组织,刮除气管粘膜及粘膜下层后,分离两侧的软骨,取出气管平滑 肌,同样无菌条件下留取骨骼肌、心、脑组织作为RyRI、RyRZ及价R3的阳 性对照;用Trizol试剂提取气管平滑肌的总RNA,采用RT一PCR方法扩增 RyR三个亚型的cDNA产物,以确定仆MC上的舜R的亚型表达。引物设 计参照Neylon和Richard等的实验,引物片段由Takara公司合成,RyRI引 物为:5’一GAAGG叨陀TGGACAAACACGGG召’;5气TcGCTCTTGTI心. TAGAA明[T GCGG一’;脚R2引物为:5气GAATCAC飞AGTTACTGGGCAT. GG一3’;5’一CTGGTCTcTGAg汀CTCCAAAAGC一3’;衍R3的引物为:5’一CCT- TCGCTATCAAC竹CATCCTGC一’;5’一TCTrCTACTGGGCTAAAGTCAAGG- 3’。扩增片段长度分别为435、635和SO5bp。RT的反应条件为:65℃ lmin,30℃smin,匀速升温至65℃30而n,98℃5而n,5℃5而n;PCR反应 总体积为25闪,反应条件为:94℃预变性Zmin后,以94℃305,57℃305, 72℃2而n的顺序,共30个循环,最后72℃延伸smin。产物经1 .5%琼脂搪 凝胶电泳后,澳化乙锭染色,并在凝胶成像分析系统进行拍照、分析。 哮喘豚鼠气管平滑肌街RZ mRNA水平变化及Sco影响的分析采用 RT一PCR方法对三组豚鼠飞MC的舜R2亚型的mRNA表达水平进行半定 量分析,以(一actin的cDNA扩增产物作为内参照,p一actin的引物序列为: 5’.TGTATGCCTCTGGTCGTACCAC召’;5’一ACAGAGTAO[T GCGCTCAGGAG- 3’;扩增片段长度为592bp。反应条件及反应体系同上。RT,PCR的cDNA 扩增产物经1 .5%琼脂糖凝胶电泳后,澳化乙锭染色,用凝胶成像分析系统 分别对目的基因价咫及p一actin扩增产物的条带密度进行扫描测定,计算 价R2/p一actin扩增产物的密度比值,以反映价R的mRNA含量,并进行组 间比较。 豚鼠血清与肺组织匀浆制备末次喷雾激发后24h内,20%乌拉坦 1 .25扩kg腹腔注射麻醉动物。于麻醉状态下,直视下心脏取血4耐,注人 试管中,待凝固后分离,以4℃巧oo转离心10分钟,取上清;取出肺组织, 吸去血迹,称取Zmg组织,尽快放人生理盐水1而研磨,然后在100℃水浴 中煮沸10分钟,匀浆,4℃3《XX)rpm离心15分钟,取上清。 I薛、IL4和IFN一,含量的测定I薛采用化学发光法测定,IL4采用放 免法测定,IF’N一,采用ABC一El


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