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脊椎裂畸形胚胎发生机制的初步研究

李勇  
【摘要】: 前言 神经管缺陷(neural tube defects NTDs)是常见的先天性畸形,也是世界卫生组织常规监测的先天性畸形之一。世界范围内其发病率占总出生儿数的1/1000~9/1000。 胚胎的神经系统发育是一个复杂的过程,发育过程中受遗传因素和环境因素双重作用的影响。神经管缺陷的病因及发病机制不清楚,认为是胚胎发育过程中多种基因调控、多种环境因素参与共同作用的结果,神经管缺陷具有一定的遗传倾向,家族再发病率接近2~5%。 神经管缺陷包括脑和脊髓多种畸形,不但本身种类和病变复杂,而且常常合并其它多个系统畸形,使病因和发病机制的研究更为困难。因此建立神经管缺陷的动物模型,从胚胎发育学和生物解剖学角度研究畸形的病因和发生机制是有必要的。本试验包括以下几个方面内容:①脊椎裂动物模型的建立:在大鼠怀孕的特定时期,投用一定量的丙戊酸钠或维甲酸,制作胎鼠的脊椎裂动物模型,观察两种不同药物诱导胎鼠发生脊椎裂畸形的特点,探讨先天性脊椎裂的胚胎发生机制。②显性脊椎裂胎鼠脊髓神经细胞凋亡和凋亡相关基因Bcl-2、Bax的表达:采用原位末端标记(TUNEL)技术和免疫组化SABC法检测显性脊椎裂胎鼠脊髓神经细胞凋亡以及凋亡相关基因Bcl-2、Bax在脊髓神经细胞中的表达,分析脊髓神经细胞凋亡与胚胎显性脊椎裂发生的关系以及Bcl-2和Bax基因在显性脊椎裂脊髓神经细胞凋亡过程中的调控作用,进一步探讨显性脊椎裂畸形的发生机制。③隐性脊椎裂胎鼠支配肛提肌的脊髓运动神经元的定量研究:采用神经解剖学常用的荧光金(FG)标记逆向神经示踪法,结合胎儿外科显微手术和显微注射技术,观察胎鼠支配肛提肌的脊髓运动神经元的改变,探讨隐性脊椎裂胎鼠支配肛提肌的脊髓运动神经元的发育情况。 实验材料 试验动物:Wistar大鼠由中国医科大学第二临床医学实验动物中心提 供。 试剂和实验仪器:丙戊酸钠、维甲酸、阿尔新蓝、茜素红、荧光金由北京 丰特斯化工材料有限公司提供;原位末端标记细胞凋亡试剂盒和即用型 SABC免疫组化染色试剂盒及基因Bcl一和Bax抗体由武汉博士德生物工 程公司购进。立体显微镜、荧光显微镜、图像分析系统均为olympus公司产 口 口口。 实验方法 ①脊椎裂动物模型制作:实验动物随机分成5组:对照组,实验组分成 丙戊酸钠三个不同剂量组和维甲酸组。体重240一3009健康成熟未孕的 Wistar大鼠,分别在确定怀孕的第9天9:oo、16:oo,按实验设计据体重计算 剂量后后肢皮下注射丙戊酸钠溶液,浓度20%。妊娠第20天剖宫,取出所 有胚胎,检查外观,判定是否有外观可见畸形并记录。然后胎鼠按染色要求 取脊柱进行骨和软骨双重染色,染色后标本采集图象经计算机软件显微图 象分析,测量出每个椎体椎弓两个软骨端距离。参照正常胎鼠确定的参考 值判定隐性脊椎裂。Wistar大鼠确定怀孕的第ro天9:oo,胃管灌人维甲酸 135 mg/kg(矿物油混悬液,4Om岁d),妊娠第20天剖宫,取出所有胚胎,检 查外观判定显性脊椎裂畸形发生情况并记录。对照组孕鼠不予任何处置, 胎鼠染色脊柱标本采集图象经计算机软件显微图象分析,测量出每个椎体 椎弓两个软骨端距离,目的确定软骨端距离参考值。 ②显性脊椎裂脊髓神经细胞凋亡及凋亡相关基因Bcl一和Bax表达: 采用原位末端标记法和免疫组化SABC法检测30例脊椎裂胎鼠和14例正 常胎鼠脊髓神经细胞凋亡状态及凋亡相关基因Bcl一、Bax蛋白的表达。神 经细胞凋亡用凋亡指数(AI)表示,AI二凋亡细胞数巧00 x 100%。基因 Bd一、Bax蛋白的表达强度用平均灰度值G表示,蛋白表达越强G值越小。 ③隐性脊椎裂脊髓运动神经元的定量研究:在大鼠怀孕20天ro%水 合氯醛腹腔注射麻醉,应用胎儿外科显微手术和显微注射技术,在立体显微 镜下用纤细玻璃针将5%荧光金分别注人胎鼠直肠两侧肛提肌;显微注射 的胎鼠存活24小时后,左心室穿刺主动脉灌注生理盐水冲洗后,4%多聚甲 醛进行灌注固定;脊柱标本阿尔新蓝软骨染色后实体显微镜下数码相机采 集脊柱软骨染色图像,输人计算机保存,计算机软件测量出胸9一能5每个 椎体椎弓两个软骨端距离并判定隐性脊椎裂;采集图像后取腰能段脊髓标 本置人20%蔗糖溶液内,24小时后连续冰冻横切片,脊髓冰冻切片荧光显 微镜下观察并计数荧光金标记的运动神经元数目,观察对比对照组、畸形组 和给药无畸形组运动神经元的数目及分布。 结果 ①脊椎裂动物模型:丙戊酸钠诱导隐性脊椎裂畸形随药物剂量加大,畸 形发生率升高,丙戊酸钠剂量400m岁kg、450 mg/kg、soom酬kg诱导畸形发 生率分别是80%、93%、100%,腰椎对丙戊酸钠的致畸作用最敏感;丙戊酸 还可以导致头端神经管畸形,但未观察到显性脊椎裂的发生。维甲酸135 mg/吨诱导胎鼠显性脊椎裂的发生率45%,畸形都发生在腰骸段,其它畸 形的总发生率高达90.7%。 ②显性脊椎裂脊髓神经细胞凋亡及凋亡相关基因Bcl-2和Bax表达: 显性脊椎裂胎鼠脊髓神经细胞凋亡数明显增多,正常脊髓神经细胞凋亡指 数为0.5%,畸形脊髓神经细胞凋亡指数24%,统计学差异极显著,p


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