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核因子κB及其相关基因在缺血再灌注所致大鼠后肢及远隔脏器损伤中的表达及意义

杨军  
【摘要】: 目的 多种原因,包括周围血管损伤、主动脉瘤手术、断肢再植等疾病治疗过程均可造成肢体缺血。恢复充足的血供是缺血组织成活的关键,然而缺血再灌注(ischemia-reperfusion,I/R)损伤却可能导致远隔器官(如心、肺、肝、肾、小肠等)的损伤。目前,I/R后肢体及远隔脏器损伤的确切机制尚不清楚。近年研究发现,多型核粒细胞(polymorphonuclear neutrophil,PMN)的黏附、浸润及炎性介质的释放在骨骼肌I/R及其所致远隔脏器损伤过程中起关键作用。细胞黏附分子(ICAM)-1的表达则是介导PMN黏附、聚集并发挥作用的先决条件,而作为转录因子的核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)的激活是上述基因表达的前提。 为研究骨骼肌I/R后NF-κB及其相关基因在骨骼肌及远隔脏器中表达的变化规律,探讨其机制及意义,同时通过局部灌注NF-κB decoy寡核苷酸及吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)抑制NF-κB及其相关基因的表达激活,检测骨胳肌及远隔脏器损伤的改变,为防治I/R所致骨骼肌及远隔脏器功能的损害提供理论依据。 方法 1.动物模型、分组及处理 雄性Wistar大鼠,体重250g±50g,随机分为:假手术组(Sham,6只),缺血组(ischemia,6只),缺血再灌注组(I/R,42只)。2%戊巴比妥钠40mg/kg行腹腔注射麻醉,分离股动脉并用无创性血管夹夹闭4h。I/R组分别于再灌注1、2、4、8、12、24、48 h股静脉采血,并取胫前肌、双侧肾及肺。另外还有PDTC组(100 mg/kg,12只)、NF-κB decoy组(200μg,12只)及杂码(Scramble decoy)组(200μg,12只),在再灌注前分别施加相应的处理因素,再灌注8 h、24 h后取材。 2.组织学研究 标本收集后,取部分骨骼肌、肾、肺叶,10%中性福尔马林固定、石蜡包埋,切片,苏木素-伊红染色。计数肺泡间隔中的PMN数代表肺部扣 押的PMN。 3.肺组织湿/干重比率 取部分肺置入真空干燥器中烘烤24h,称量组织重量。计算肺组织湿 /干重比率作为肺水肿的标志。 4.MDA和MPO的检测 参照丙二醛(MDA)或髓过氧化物酶(N田O)试剂盒说明检测肺、肾组织 的MDA和MPO,分别作为脂质过氧化和PMN浸润的指标。 5.半定量Rl’- PCR 采用Trizol提取总RNA,逆转录为cDNA,进行PCR扩增。PCR条 件:94oC变性2 min,94 oC 3 05,5 5 oC 305,72oC 455,共30个循环,72oC 延伸5 min。2%琼脂糖电泳,凝胶成像系统上摄像并分析吸光度值。 基因表达值=NF一忍p65(ICAM一1,I一沼p)/p一actin 6.原位杂交 标本固定、脱水,ocT包埋后冰冻切片。按照NF一虑p65 mRNA或 ICAM一1 mRNA检测试剂盒说明进行染色。光镜观察:400x镜下,计数单 位视野内阳性细胞数占总细胞数百分比。 7.M触stem blot蛋白印迹 剪碎组织后置于裂解液中机械匀浆并提取总蛋白,测总蛋白质浓度。 10%SDS一聚丙烯酞胺凝胶电泳、转膜。5%脱脂奶粉封闭,一抗NF一忍p65、 I一出p、IeAM一l、TNFa或aet认(1:一000),4oC过夜,洗膜,加入过氧化物 酶标记的马抗山羊IgG.HRp,洗膜后加ECL,暗室显影后冲洗胶片。凝胶 成像分析系统上摄像分析,计算出吸光度值。 8.免疫组织化学染色 石蜡切片,常规脱蜡至水;按试剂盒说明染色。光镜观察:400x高倍 镜下,计数单位视野内阳性细胞数占总细胞数百分比。 9.统计学分析 结果用*士s表示,采用SSPS10.0软件分析各组数据,组间比较采用t 检验。 结果 组织形态学改变 缺血组的骨骼肌纤维间隙增宽,部分肌纤维水肿、变性;再灌注1一 8h,毛细血管扩张充血,在组织中有较多白细胞浸润,肌纤维水肿;再灌 注8~12h,肌纤维变形、变粗,结构模糊,肌溶严重,可见大量白细胞浸 润;再灌注24~48h,肌纤维水肿、变性有所改善,逐渐恢复正常;假手 术组无明显变化。 再灌注4h,肾脏即出现组织学改变,表现为肾小管上皮细胞水肿,8一 12h表现最为明显,48h基本恢复正常。再灌注4h,I瓜组肺组织病理切片 提示有明显的弥散功能障碍,表现为间质浸润细胞增多并伴有水肿,肺毛 细血管床内可见大量的PMN聚集、附壁。肺泡中有淡红色渗出液及PMN 渗出,局部肺不张,再灌注12h尤其明显。假手术组和缺血组的肺或肾小 管和肾小球结构无明显改变。 再灌注sh,NF一出decoy组和PDTc组的骨胳肌、肺及肾小管上皮细 胞水肿明显缓解,间质浸润的炎性细胞亦减少;24h骨胳肌、肺及肾组织 学改变基本恢复正常。 2.血浆BUN、Cr及肺PMN、组织率(w/T)的改变 I瓜组各时点,血浆中BUN、Cr较假手术组和缺血组明显增加,差异 有非常显著意义(P0.01)。I瓜组肺组织湿/干重增高,再灌注24h最为明 显,与假手术组和缺血组比较差异均有显著意义(P0.01)。肺泡间隔中的 PMN计数在I瓜组均显著增加。NF一沼decoy和PDTC处理能够改善肾功 能,减轻肺PMN扣押和湿/干重比。 3.MDA、MPO的检测 1爪组肾或肺组织MDA和MPO活性显著增高,与缺血组比较差异有 显著意义(P0.01)。早在再灌注4h即明显增高,12


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