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吗啡预处理的晚期心肌保护作用及其与诱导型一氧化氮合酶的关系

师恩祎  
【摘要】: 目的 心肌缺血及再灌注损伤是缺血性心脏病的重要病理生理过程。对抗缺血再灌注损伤保护心肌组织对于冠心病以及体外循环术后心肌损伤的防治具有重要意义。Murry等首先发现并提出了缺血预处理(Ischemia preconditioning,IPC)的概念。现在已经公认IPC存在双期保护作用。晚期预处理的保护作用维持时间更长,因此更具有临床意义。新近的研究表明同IPC相似,缺氧等其他一些刺激和一些药物预处理也可以产生早期和/或晚期心肌保护作用。药物预处理方法简单,没有创伤,剂量容易控制,因此更具有临床应用前景。 研究表明阿片受体参与介导了IPC的心肌保护过程,而且激动阿片受体同样可以产生心肌保护作用。吗啡是广泛应用的非选择性阿片受体激动剂,其预处理的早期心肌保护作用已经得到证实,但目前尚不清楚吗啡是否可以产生晚期心肌保护作用。 新近的研究表明诱导型一氧化氮合酶(iNOS)在预处理的心肌保护过程中发挥重要作用。iNOS经过诱导后,其在体内的表达水平可以升高。多种生理刺激和药物预处理后,心肌组织中iNOS的表达可以显著升高,并参与触发和/或介导晚期心肌保护作用。内皮型一氧化氮合酶(eNOS)主要参与预处理后的早期心肌保护作用,但也有的研究认为eNOS参与了预处理的晚期心肌保护过程。吗啡可以引起多种细胞释放一氧化氮(NO)并可以促进巨噬细胞中iNOS的表达。但关于一氧化氮合酶(NOS)和阿片类物质预处理心肌保护作用关系的研究甚少。目前还不清楚NOS是否也参与了吗啡预处理的心肌保护过程。 本研究建立小鼠在体冠状动脉阻断再灌注模型,旨在证实吗啡预处理 的晚期心肌保护作用,并利用iNOS选择性抑制剂和iNOS基因敲除技术探 讨iNOS在此过程中的作用。 方法 一、材料 实验动物:成年雄性iNOS基因敲除(一/一)小鼠(B6,129)和具有相 似基因背景的野生型小鼠(B6 1 29Pn/J)。 二、方法 1.冠状动脉阻断再灌注模型的建立:苯巴比妥钠麻醉小鼠。气管切开 插管后连接小动物呼吸机进行机械通气。右颈内动脉插管连接监护仪监测 平均动脉压(MABP)和心率(HR),并计算R卫P:MABP xH甲1000。维持小 鼠中心体温在36.5一37.5℃之间。用7一0丝线(Prolene)于近起始处结 扎冠状动脉左前降支(LAD)。结扎处远端心肌颜色变成灰白色作为成功 阻断冠状动脉的标志。45 min后,松开结扎线。原缺血处心肌充血作为心 肌再灌注的标志。 2.实验分组:所有动物均给与45 min心肌缺血和120而n再灌注。野 生型小鼠随机分为5组:(1),Saline组:心肌缺血前24小时给与生理盐水 腹腔注射(Sahne,0.Ilnl,IP);(2),MO.l组:心肌缺血前24小时给与较小 剂量吗啡预处理(0.lmg/kg,Ip);(3),M0.3组:心肌缺血前24小时给与 较大剂量吗啡预处理(0.3mg/kg,IP);(4),Saline+SMT组:心肌缺血前 24小时给与生理盐水(0.1血,IP)并于心肌缺血前30分钟给与SMT( 3mg/kg,Ip);(5),M0.3+sMT组:心肌缺血前24小时给与较大剂量吗啡 预处理(0.3m扩kg,Ip)并于心肌缺血前30而n给与SMT(3m扩kg,Ip); iNOS基因敲除(一/一)小鼠随机分为2组:(6),iNOS一KO+Saline组:心 肌缺血前24小时给与生理盐水(0.Ilnl,IP);(7),iNOS一KO+M0.3组: 心肌缺血前24小时给与吗啡预处理(0.3m岁kg,IP)。 3.心肌缺血区和心肌梗死范围的测定:心肌再灌注120而n后,重新结 扎LAD。经右颈动脉插管逆行注人Evans蓝溶液。横行将心脏切成5片并 置人1%T况溶液中37℃染色5而n。固定后,进行数码照相并称重。左心 室(Lv),缺血区(AAR,非蓝色区)和心肌梗死区(Is,灰色区)面积用NIH Image(,ersion 1 .57)软件计算。梗死心肌重量按如下公式计算: 梗死心肌重量=(Al x WI)+(AZ x WZ)+(A3 xW3)+(A4 xW4) +(AS xWS) (A:梗死心肌面积占左心室面积的百分比;W:心脏切片的重量;l- 5:心脏切片编号)。 心肌缺血区重量按类似的方法计算。心肌缺血区范围用心肌缺血区重 量占左心室重量百分比(AA份Lv)表示。心肌梗死范围用心肌梗死区重 量占心肌缺血区重量百分比(IS/从R)表示。 4.Westem Bfot:为检测不同剂量吗啡对小鼠心肌组织中iNOS和eNOS 表达的影响,所有小鼠均在预处理后:l4小时处死。野生型小鼠分成3组。 l,Saline:生理盐水(Salineo.Ilnl,IP)预处理;2,M0.1:小剂量吗啡(0.lm扩 吨,IP)预处理;3,MO .3:大剂量吗啡(0.3m扩kg,IP)预处理;iNOS基因敲 除小鼠分成2组。4,训05一KO+S止ne:生理盐水(0 .Ilnl,IP)预处理;iNOS 一KO+MO .3:吗啡(0 .3m岁kg,IP)预处理。为检测吗啡预处理后不同时 间心肌组织中iNOS的表达情况,野生型小鼠给与吗啡(0.3m扩kg,IP)预处 理,并分别于给药后0.5小时,l小时,2小时,6小时,12小时,一8小时, 24小时处死动物。以没有给与吗啡预处理的小鼠作为对照。 小鼠心脏切碎,研磨成匀浆。组织匀浆离心后取上清,作为全细胞蛋 白。测定样品的蛋白浓度。用8%SDS Polyacrylamide胶进行蛋白分离。 每孔加人蛋白样品60林g电泳约1小时。然后将胶中分散的蛋白转移至ni- trocen己ose膜。用Ponceau溶液进行?


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