成骨细胞、血管内皮细胞复合异种骨脱细胞细胞外基质构建组织工程骨的实验研究

【摘要】： 目的 种子细胞的培养是组织工程的基本要素。研究种子细胞的目的在于获取足够数量的接种细胞，同时保持细胞增殖、合成基质等生物功能并防止细胞老化。成骨细胞(osteoblast，OB)是骨组织工程的种子细胞，然而组织工程骨修复骨缺损的基础依然是它的血管化。如能将OB与血管内皮细胞(Vascular endothelial cells，VEC)联合培养，使其既能促进OB的增殖活性、又能加速组织工程骨再血管化进程，将有助于增强组织工程骨修复骨缺损的能力。组织工程的基本培养方法是将体外培养的、高浓度的组织细胞扩增后吸附于一种生物相容性良好，并可被人体逐渐降解吸收的细胞外基质(extracellular matrix，ECM)上，种植的细胞在生物支架逐步降解吸收过程中，继续增生繁殖，形成了新的具有其原来特殊功能和形态的相应组织和器官，达到修复创伤和重建功能的目的。随着社会的飞速发展，交通运输、机械化程度的不断提高，高速、高能量的创伤所导致严重复杂骨折，常引起骨缺损、骨折不愈合。自体移植由于骨源及供骨部位有限，同时自体组织塑型困难等缺陷，限制了其在临床的推广应用。同种异体骨移植有一定的免疫排斥反应，组织工程化骨为解决这一问题提供了一条新的途经。本实验采用自行研制的脱细胞猪肋骨，复合兔OB和VEC，构建组织工程骨植入动物体内，对其生物相容性进行体内、体外观察研究，探讨异种骨移植在体内成骨、修复骨缺损和再血管化的病理过程，为组织工程骨临床应用提供理论依据。 方法 1．组织工程种子细胞培养和细胞相容性研究 1 .1细胞培养 培养兔成骨细胞(osteoblast，OB)A组、血管内皮细胞(Vascular endo- thelial。ells，VEC)B组、OB与VEC联合培养C组。 1 .2观察指标 1 .2.1倒置相差显微镜观察 倒置相差显微镜下观察3组细胞形态和生长情况。 1 .2.2免疫细胞化学染色 I型胶原免疫细胞化学染色，鉴定OB。血管恤因子免疫细胞化学染 色，鉴定VEC。 1 .2.3组织学观察 联合培养的细胞制作爬片。3天后分别做HE染色和M~n三色染 色，观察两种细胞混合生长的情况。 1 .2.4碱性磷酸酶(砒日ine phosPhatase，ALP)活性检测 采用对硝基苯磷酸盐法，测定ALP活性，观察VEC对OB产生的ALP 活性有无影响。 1.2.5四甲基偶氮哇盐(methythiazolyl tetr即泊liulnbro而de，MTT)法检 测细胞活力 分析3组细胞生长和增殖情况。 2，异种骨脱细胞细胞外基质(acell公ar extlacenular matrix，AECM)对 OB与VEC生物相容性研究 2.1制备异种骨AECM支架材料 新鲜猪肋骨经双氧水、氯仿/甲醇、TritonX一100进行脱脂、脱抗原和 脱细胞处理，制备成异种骨AECM支架材料，进行扫描电镜观察。 2.2细胞与异种骨AECM复合 3组兔细胞分别与脱细胞猪肋骨复合，对异种骨AECM的生物相容性、 抗原性和生物毒性进行观察、研究。 2 .3观察指标 2.3.1倒置相差显微镜观察 观察细胞与异种骨AECM的粘附，细胞在异种骨AECM孔隙内分布， 细胞生长、分化和增殖情况。 2.3.2组织学观察 一3组细胞与异种骨AECM复合培养sd后，分别行皿、甲苯胺蓝及Mas- son三色法染色。观察生物相容性。 2.3.4扫描电镜观察 观察细胞在异种骨AECM上粘附、生长、增殖和基质分泌情况。 2.3.5流式细胞仪检测 3组细胞与材料在培养板中复合培养，于ld、3d、sd，、7d，各组分别取细 胞材料复合物3根，消化收集细胞并计数，用流式细胞仪进行细胞周期和 倍体水平分析，了解异种骨AECM对细胞有无毒性影响。 3.异种骨AECM复合细胞植人动物体内实验研究 3.IB记U(5一澳脱氧尿啼吮)标记细胞 用B川U对3组兔细胞进行标记，分别与脱细胞猪肋骨复合，制备成组 织工程骨，进行体内骨缺损修复。 3.2动物实验 取体重为2.0一2.5公斤新西兰大耳白兔27只，分为3组，每组9只动 物。切除兔双前肢1.scm长挠骨制成骨缺损动物模型，左侧植人异种骨 AECM与各组细胞复合培养l周的组织工程骨，右侧植人异种骨AECM为 对照。分别于3周、6周、12周取材，观察骨折愈合情况。 3 .3观察指标 3 .3.1大体形态观察 肉眼观察各时相组织工程骨在体内的发育和转归。 3 .3.2骨缺损X线检查 了解植人组织工程骨与周围正常挠骨的结合情况，以及骨缺损部位骨 痴形成、变化和塑形。 3 .3 .3 Brdu标记细胞示踪检测 了解种子细胞在实验动物体内成活情况。 3 .3 .4常规组织学检查 各时相点取材，制作石蜡切片，现、甲苯胺蓝、Masson染色，观察异种骨 移植在体内成骨、修复骨缺损和再血管化的病理过程。 3 .3.51型胶原免疫组化 了解各时相点各组细胞分泌I型胶原的情况。 3 .3.6图像分析 选取组织工程骨与正常骨交界部位，用图像分析仪，测量单位面积内的 血管面积。 4.统计学方法 实验结果以均数土标准差表示，组间计量资料比较采用SPSS 10.0软 件包行方差分析和q检验。 结果 1.