nephrin、α3/β1-integrin及α-actinin在阿霉素肾病蛋白尿产生中的作用

【摘要】： nephrin、α3／β1-integrin及α-actinin在阿霉素肾病蛋白尿产生中的作用 目的 肾小球足突细胞及其足突间的裂孔隔膜构成肾小球滤过屏障最重要的部分。近年来，已先后确定了多个位于足突细胞及裂孔隔膜的蛋白分子如α3／β1一integrin、nephrin、podocin和α-actinin-4等，并证实这些分子对维系裂孔隔膜正常结构和滤过屏障的功能起关键作用。 足突细胞是由细胞体、大足突及足突构成。一般情况下，细胞体和大足突不直接与肾小球基底膜(GBM)连接，而是自由地悬在尿腔，足突细胞主要通过足突与GBM连接而固定在毛细血管袢上。α3／β1-integrin为足突细胞膜受体，与GBM基质相粘连，在将足突固定到GBM上起重要作用。nephrin属免疫球蛋白(Ig)超家族分子，为一跨膜蛋白，包括胞内区、跨膜区和胞外区。胞内区参与细胞信号传导，胞外区为足突裂孔隔膜的分子结构基础，具有分子屏障作用。α-actinin为actin-结合蛋白成员之一，目前已鉴定出四种亚型，分别为：非肌性α-actinin-1和α-actinin-4，肌性α-actinin-2和α-actinin-3。在肾小球脏层上皮细胞仅有α-actinin-4表达，α-actinin-4一方面将actin细胞骨架与裂孔隔膜分子连接起来，另一方面它又通过与足突细胞膜受体α3／β1-integrin相互作用与GBM连接，在足突细胞分子复合物中起核心调节作用。 已有的研究表明编码nephrin和α-actinin-4分子的基因突变分别可引起芬兰型先天性肾病综合征及家族性局灶节段性肾小球硬化，此外α3-integrin和nephrin编码基因敲除小鼠也发生先天性蛋白尿。由此可见，足突细胞及裂孔隔膜的蛋白分子在蛋白尿的发生、发展中起着关键作用。 微小病变模型是研究肾小球性蛋白尿常用的模型，大鼠阿霉素肾病模型为公认的微小病变模型。本实验将通过给鼠尾静脉注射6.5mg／kg阿 霉素复制该模型，动态观察阿霉素注射后3天、7天、14天、21天及28 天尿蛋白、血生化及光镜、电镜下肾组织病理改变，应用免疫荧光、 we stern b10t及逆转录一聚合酶链反应(RT一PCR)法检测肾小球内 nephrin、a3/pl一integrin和a一actinin一4的分布及其蛋白水平、mRNA 水平，以探讨nephrin、a3/pl一integrin和a一aetinin一4在阿霉素肾 病蛋白尿产生中的作用。 材料与方法 一、阿霉素肾病模型建立 雄性SD大鼠45只，体重200一250克，随机分为实验组(40只)和对 照组(5只)。大鼠尾静脉一次性注入阿霉素6.Slng/kg，以标准饲料饲养， 自由摄食及饮水，存活的大鼠7天、14天时尿蛋白定量100mg/24h提示 模型复制成功，计入实验;对照组(5只):鼠尾静脉一次注射等量生理盐 水。 二、标本收集 各组均于注射阿霉素前一天、注射阿霉素后第3天、7天、14天、 21天及28天用代谢笼收集24小时尿液，对照组于第28天，实验组于 收集尿液结束当天各取大鼠5只，异戊巴比妥麻醉，心脏穿刺采血，剖腹 取肾，留取肾组织标本，用于光镜、电镜、免疫荧光检查及Western blot 及RT一PCR检测. 三、常规指标测试 采用柳氮磺酸比浊法检测尿蛋白定量;用日立7600全自动生化仪检 测血总蛋白、白蛋白、胆固醇、甘油三醋及尿素氮、肌醉;4%多聚甲醛 固定的标本经常规方法进行HE及PAS染色，光镜下观察;随机选取2.5% 戊二醛固定的肾组织2块，经常规方法制备成透射电镜切片，醋酸铀一构 椽酸铅双重染色，透射电镜下观察。 四、nephrin、。3/pl一integrin及a一actinin的检测 1.免疫荧光:冰冻组织切片spm，丙酮固定，一20℃10min，o.olMPBS 洗smi n x3;正常山羊血清封闭30min，甩干;滴加兔抗大鼠nephrin、 Q3/pl一integrin及小鼠抗人a一aetinin(浓度分别为1:50，1:50， 1:50和1:100，)，37oC分别孵育lh，Zh，Zh，Zh，0.olMPBS洗smin x3;滴加二抗(羊抗兔IgG一FITC及山羊抗小鼠工gG一FITC，浓度均为 1:50)，37oC孵育30min，0.OIMPBS洗sminx3;滴加甘油，封片，荧 光显微镜下观察;根据肾小球血管拌上荧光染色的强度和分布定为0一3+ 级，0级，阴性;十，少量，高倍镜下阳性;2+，中等量，散在，不连续， 低倍镜下阳性;3+，大量，呈线样或带状分布。由两个观察者对每个样 本的免疫荧光切片进行盲法评定，每个样本观察40个肾小球，然后取两 者的平均值。 2.分离肾小球:将ZO0mg(用于Western blot)、IOomg(用于RT一PeR) 肾皮质剪碎，依次经250 pm、1 50 pm和105 pm筛网滤过，获得的组织 经显微镜下鉴定为肾小球，保存待测。 3.Western blot:用组织裂解液A和B提取肾小球细胞的胞浆和胞 膜蛋白，Lowry法测定蛋白含量。分别取胞膜蛋白40 pg及胞浆蛋白40 p 9， 40 pg，40pg，分别经7.5%及10烧Ds一以GE凝胶电泳后，转移至 硝酸纤维素膜上。然后用含5%脱脂牛奶的TTBS4℃封闭lh，洗膜后加入 兔抗大鼠nephrin、a3/pl一integrin及小鼠抗人a一aetinin(浓度分 别为1:400，l:400，1:400和1:600)，进行杂交，再用ALP标记的 羊抗兔IgG及羊抗小鼠IgG(浓度均为1:2000)进行二抗杂交，最后加 入ALP显影剂显影。杂交结果在Chemi Image5500电泳凝胶成像分析系统 中进行吸光度分