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离体培养的感觉神经细胞突触中Sensorin基因表达的实验研究

柳柯  
【摘要】: 目的 长期以来,在神经领域的科学家们一直对生物包括人类本身在接受外界所给予的刺激后都能迅速有效的作出相应反应的过程表现出了浓厚的兴趣。当前世界上有数量众多的实验机构和专业研究人员在此领域内进行各个相关分支的研究。过去的几十年来,研究人员取得了很多令人鼓舞的研究成果。在那些科学家中,Eric kandel和Samuel Schacher都是成就卓著的科学家。早在上世纪50年代,当时还是神经科医生的Eric kandel就发现了海生动物Aplysia是一种可以作为不同神经元之间信号传导研究的十分理想的目标。本世纪70年代,Samuel schacher等人经过三年的摸索,最终成功的建立了将单个的感觉神经细胞(SN)和单个的运动神经细胞(MN)连接起来,并且可以在体外培养的反射弧模型。近二十年来,研究人员利用这种模型进行了很多重要的实验研究并取得了丰硕的成果。 这其中有相当一部分研究工作的结果表明,有些中枢神经(SNS)系统中的特定突触联系是通过细胞和分子的相互作用过程而建立起来的。突触的建立(Formation)和维持依赖于众多基因的相应表达。进一步说,某些突触联系有赖于特定基因编码的蛋白质被转运到神经细胞的特定区域(Local site)的一系列复杂过程。 近十年来,许多科学家倾向于认为,在Aplysia的DNA序列内中存在的由Sensorin基因序列所负责编码的特定蛋白质在突触之间的转运过程,可能与突触的形成(Formation)和稳定(Stability)有关,并且与突触的长时程强化(LTF)之间有某种程度的联系,而且这种蛋白质的运输过程可能与感觉信号由感觉神经(SN,突触前)通过突触间隙传递到运动神经细胞(MN,突触后),并与产生相应的生物学行为等一系列生理,生化和分子生物学反应有密切的关系。 尽管很多研究人员在这个研究方向上付出了不懈的努力,但是由这种基因编码的蛋白质始终没有被人们在突触中明确的找到。这样的结果导致了对于感知、学习、记忆和行为等诸多生理心理过程的研究显得进展缓慢。 因此我们的研究旨在从离体培养的突触(Isohted SynaPse)内标记出这 种蛋白质,并探索不同的生理条件对此特定蛋白合成(乃mtein synthesis)过 程的影响。 方法 Aplvsia细胞的培养: Aplrsia感觉神经元(SN)从成年动物的神经节分离出来。A两sia运动 神经元(L7L 11)从幼年动物的腹部神经节中取得。在特定的培养皿中将 两个细胞的轴突相接触,建立体外的反射弧模型,分别为SN/L7模式(用做 实验组)和SN/Lll模式(用做对照组)。并在特定条件下培养1一3天,之后 模型可以被.应用于实验。 在本实验中,我们建立这样的体外细胞培养模式,即在培养皿中分别把 两个感觉神经细胞(SNS)和运动神经细胞L7连接,使其建立稳定的突触联 系。在测定感觉神经细胞诱发的兴奋性突触后电位(EPSP)后-一种用来检 测突触效率的的电生理指标。切除其中一个感觉神经细胞(SN)的胞体,然 后继续体外(In vivo)的培养过程。在后续的实验中,分别用突触长时程强 化(LTF)刺激物质5一经色胺(5一HT)和蛋白质合成抑制剂一茵香霉素(Aniso- mycin)以及对照试剂来处理。 标准的电生理技术: 用来记录感觉神经元(SN)在运动神经元(L7)激发出来的动作电位 (EPSP),感觉神经细胞的动作电位不会在运动细胞(Lll)中诱发出相应的 动作电位。这是体外细胞培养SN/Lll模式可以作为本实验对照的理论基 础。 免疫组织化学技术: 培养标本经过漂洗(Wash out),固定(F议ed)后室温放置。经过减低背 景(Blocking)处理。然后应用一抗(Prim娜antibody)标记,在摄氏4度下过 夜。次日经过三次漂洗后再应用二抗(second娜antibody)标记处理,室温 下放置一小时,然后再漂洗,完成后观察实验结果并拍照记录。 结果 离体培养的突触(Isolated synapses)表达长时程强化(LTF),这种长时 程强化具有两个重要特征:第一是它会表现出迅速的衰减;第二是它依赖 于蛋白质的合成。 表达长时程强化(LrF)的离体突触(isolated synapse),经过5,翘色胺 (5一HT)处理24小时以后进行观察和统计学分析,我们发现,在与同一个 运动神经元(L7)相连的的两个感觉神经细胞(SNS)之间,此种突触模式为 ZSNS/L7,被切除胞体的感觉神经元(SN)所表达的长时期程强化(LTF), 与仍然保留胞体的的感觉神经元(SN)相比较有明显的增加。诱发性突触 后电位(E玲P)数值: 205,1(12.2%(5一HT一CB)。 154.3(6.0%(5一HT CB) 两组数据间差异明显(p0.05)。 离体培养并被切除胞体的感觉神经细胞(SN)表达的长时程强化 (LTF)同未被切除胞体的感觉神经元(SN)在应用5一经色胺(5一HT)的条件 下相互比较,前者持续的时间相对短暂(Transient)。本实验取48小时做为 时间位点,我们进行由上述二组实验中测出的诱发性突触后电位(EPSP)的 数据比较。结果发现: 无胞体实验组经过5一经色胺(5一HT一CB)处理(Isolated synapse)的均值 为:124.9土1 1.1%。 而应用5一经色胺(5一HT+CB)并保留细胞体的实验组在48小时的数据 为106.5土6.2%,二者并无统计学上的差


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