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实验性脑出血血肿周围组织中IL-2、IL-8的变化及意义

刘海峰  
【摘要】: 目的 脑出血(ICH)是指非外伤性脑实质出血,是一种发病率和致死率非常高的疾病。由于对ICH后神经元损伤的病理生理过程缺乏深入的了解,目前仍缺乏有效地治疗ICH的方案。炎性细胞因子的合成和释放发生在局灶脑缺血及创伤性脑损伤的早期。在实验性中枢神经系统损伤中,炎性细胞因子和其mRNA的产生先于多巨核细胞和单核细胞的渗透,或同时出现,这表明炎性细胞因子和其mRNA在神经损伤的病理生理过程中起作用。随着脑出血的发病机制研究的不断深入,多数学者发现炎性细胞因子直接参与了脑出血后许多病理生理过程。 炎性细胞因子是一类具有广泛免疫活性的小分子多肽,由免疫细胞、单核巨噬细胞、淋巴细胞、纤维母细胞、血管内皮细胞等合成,参与绝大部分类型的免疫反应。现已证实,中枢神经系统具有与外周免疫系统相同的抗原提呈、抗体产生、补体和细胞因子合成及细胞吞噬等免疫应答过程。应用基因表达分析发现,神经元本身可合成大量的炎性细胞因子及受体,同时表达多种炎性细胞因子受体。脑损伤及炎症、感染等情况可导致外周免疫细胞进入脑内,或激活神经胶质细胞、神经元等分泌炎性细胞因子,参与脑水肿的发生、发展以及神经元损伤、修复与再生。目前已经发现,神经胶质细胞与神经元可分泌白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-3(IL-3)、白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、转化生长因子(TGF)等,其作用呈现一过性和区域性。炎性细胞因子对免疫反应等有重要的调节和介导作用。 IL-2、IL-8是介导免疫反应的主要炎性细胞因子。目前,脑血管疾病中有关IL-2、IL-8研究较多的是在脑梗塞方面的变化和应用,在ICH方面的报道较少。本实验采用未抗凝新鲜自体动脉血注入大鼠尾状核建立ICH模型,应用放射免疫法测定ICH后各个时间点脑组织中IL-2、IL-8含量,同时应用湿重-干重(wet-dry weight)法测定脑含水量的变化,以探讨ICH后血肿周围组织中IL-2、IL-8的表达及其意义。 材料与方法 一、研究对象 1.实验动物的分组:健康雄性Wistar大鼠33只,体重320土209,由中 国医科大学实验动物部提供。随机分为对照组(假手术组n二9)和实验组 (n二24)。对照组按观察时间点分为ld组(n=4)和3d组(n二5);实验组 按观察时间点分为6h(n=5)、ld(n二5)、3d(n=5)、6d(n二5)、1 od(n=4) 组。 2.动物模型制作方法:参照张新江等〔’〕的方法并做改进。将大鼠用10 %水合氯醛(350m扩kg)腹腔麻醉,固定于脑立体定向仪(江湾I型)上。备 皮后于无菌条件下头部正中纵形切口,暴露前自和冠状缝,在前自前0.2 IInn、中线右侧旁开3nnn处用直径1~的牙钻钻孔。用1血的注射器经股动 脉抽取200闪血,经颅骨的钻孔将注射器垂直插人脑内6~(相当于尾状 核的部位)。缓慢注血100闪。对照组的步骤基本同实验组,仅将注射器插 人右侧尾状核,不注血,停留20分钟后拔出。各组实验动物观察至相应时 间点断头处死,开颅取脑。 3.标本采集及处理 a)脑组织的选取:将鼠脑沿针道冠状切开,从针道前后各切下一张厚 约1.5~含有血肿的冠状脑片,弃用剩余脑组织,针道前面的脑片行IL- 2、IL一8水平的测定;针道后面的脑片行脑组织含水量的测定;将每张脑片 沿正中切开,用于左右侧对照。用电子分析天平(精确度为0.00019)称取 后半脑片的湿重,并做记录。然后将选取的脑片立即冷藏于一70℃的冰箱 中。 b)脑组织匀浆标本的制备:将待测IL一2、lL一8的脑片分别放入2成 离心管中,加人生理盐水1耐,放人冰浴中,用玻璃棒充分搅动成匀浆,匀浆 液经4℃,20,000rpm离心20分钟后,提取上清液,迅速冷藏于一70℃冰箱 中。 二主要试剂及仪器 1.主要试剂:IL一2和IL一8放射免疫试剂盒由中国人民解放军总医 院科技开发中心放免研究所提供。 2.主要仪器:冰箱、烤箱、高压锅、离心机、电子分析称、天平、脑立体定 向仪、温度计、无菌小瓶、试管、,一放射免疫计数器。 三实验方法 1,脑含水量的测定:将待测的脑片放人100℃烤箱中,28小时后取出 称其干重,用(湿重一干重)/湿重x 100%计算含水量。以脑含水量代表脑 水肿的水平。 2.IL一2、IL一8含量的测定:采用放免法测定IL一2和IL一8的含量。 试剂盒均由中国人民解放军总医院科技开发中心放免研究所提供。严格按 照试剂盒说明书进行操作。用FJ一2008PS型,一放射免疫计数器测定每 管沉淀物的C/min值。根据标准曲线和样品管中的B/BO分数计算出样品 中的IL一2、IL一8的含量。 四统计学处理 所得数据以均数土标准差(又士SD)表示,应用SPsS10.0将IL一2、IL- 8测定的数据及脑含水量的数据分别行单因素方差分析(one一way ANO- vA)及相关分析。 实验结果 1.脑组织中lL一2的表达:与健侧及对照组比较,血肿周围组织中IL 一2水平于出血后6h、ld显著降低,3d时轻度降低,6d时明显升高达高峰, 以后逐渐下降,rod时接近正常,差异无显著意义。表明血肿周围IL一2水 平于大鼠ICH后开始下降至最低,继而逐渐上升至高


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