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大肠杆菌血脑屏障侵袭基因ibeB的功能分析

赵伟东  
【摘要】:目的 在对病原微生物与宿主细胞相互作用的研究过程中发现,病原微生物必须运送效应分子(Effector molecule)到达宿主细胞表面或者进入宿主细胞才能对宿主细胞产生影响。这些效应分子可以参与并影响宿主细胞特定的信号通路(如细胞骨架,phosphatidylinositol-3 kinase),从而有助于病原微生物对真核细胞的侵袭。对这些信号通路和相关效应分子的研究既可以帮助了解病原体的感染机制,又能为阐明细胞的生命活动提供线索。 许多革兰氏阴性病原菌利用Ⅲ型或Ⅳ型分泌系统(Type Ⅲ/Ⅳ secretion system)以及相关的效应蛋白介导其对非吞噬性细胞的侵袭作用。例如,沙门氏菌(Salmonella)利用Ⅲ型分泌系统分泌的效应分子SopE来对小分子GTP酶Cdc42和Rac发挥作用,引起真核细胞肌动蛋白的膜皱褶(Membrane ruffles)变化,从而使细菌被吞入宿主细胞;单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes)的InlB蛋白可以和真核细胞表面的肝细胞生长因子受体(Hepatocyte growth factor receptor,HGF-R or Met)结合,通过引起一系列的信号分子的变化,使细菌能够进入宿主细胞。 大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)是新生儿脑膜炎最常见的致病菌。大肠杆菌性脑膜炎一般是由于细菌的血行播散引起的,但是,血液中的大肠杆菌如何穿过由脑微血管内皮细胞(Brain microvascular endothelial cells,BMEC)组成的血脑屏障,目前还不很清楚。因此,了解大肠杆菌穿过血脑屏障的分子机制可望为新生儿细菌性脑膜炎的防治提供新的干预靶点。 本室陈誉华在研究大肠杆菌穿过血脑屏障机制的过程中,分离鉴定了一个E.coli K1侵袭脑微血管内皮细胞、穿越血脑屏障相关的基因,并命名为ibeB(ibe取自invasion of brain endothelial cells),并且证实ibeB基因参与了E.coli K1对血脑屏障的侵袭过程。ibeB的ORF大小为1383bp,推断的编码蛋白为50kD。但IbeB蛋白在E.coli K1穿过血脑屏障过程中的确切功能尚不清楚。研究表明,ibeB基因编码一个50kD的前体蛋白,该前体可自我加工成34kD的定位于细菌外膜的成熟蛋白,这与细菌V型分泌蛋白家族成员有一定的相似性,我们推断IbeB蛋白可能通过V型分泌的方式 进人真核细胞并发挥作用。 最近,本实验室观察到一个新的现象:将i决B基因转染至鼠胚胎干细 胞后可以引起类神经细胞的形态变化,以及触发神经干细胞前体细胞的标 志性蛋白—Nestin的表达。 基于此,本研究采用基因转染的方法,利用真核表达载体,对ib。B基因 在人宫颈癌上皮细胞(Hela)中的高表达所产生的影响进行了研究。通过 对Hela细胞进行稳定转染以观察i阮B基因对Hela细胞生物学特性的影 响,并对IbeB蛋白发挥作用的分子机制进行了探讨。 方法 l真核表达载体的构建 1.1提取peDNA3/7C(含有ibeB基因)和Invitrogen公司载体peDNA3. 1/HisC质粒DNA,将ibeB基因全长(1 .7kb)定向克隆至peDNA3.1/HisC, 命名为peHis一i乙eB 1.2双酶切验证克隆是否成功,将PcHis一iboB送交测序,验证iboB基 因读码框的正确性 1.3利用QiagenM记1 rep质粒DNA中量提取试剂盒,分别提取PcD- NA3 .1/HisC和peHis一ibeB质粒DNA 2稳定转染Hela细胞 2.1利用Fugene TM 6 transfeetion reagent,对Hela细胞进行转染,通过10 一14天的G418筛选,挑取单克隆,扩大培养,形成能够稳定传代的细胞克 隆株 2.2利用His一t鳍的抗体,用Western blot方法检测His6一IbeB融合蛋 白的表达,以此来鉴定转染成功的单克隆细胞株 3观察稳定转染ib。B基因的单克隆Hela细胞株生物学特性的变化 3 .1倒置光学显微镜下观察细胞的形态、贴壁状态 3 .2利用荧光技术观察细胞的细胞骨架组分一微丝的变化 3 .3细胞粘附试验观察细胞在底物上的贴附能力 3 .4细胞伸展试验观察细胞的伸展能力 3 .5划痕愈合试验观察细胞的运动能力 3 .6免疫荧光技术观察细胞的Vinculin的变化 4检测E.coliKI对稳定转染ib。B基因的Hela细胞的侵袭力变化与细 胞骨架改变的关系 4.1利用荧光技术观察稳定转染iboB基因的Hela细胞的细胞骨架微 丝的变化 4.2利用微管蛋白的抗体,通过免疫荧光技术观察ibeB基因的表达对 Hela细胞微管的影响 4.3利用中间纤维Nestin的抗体,通过免疫荧光技术观察ibeB基因的 表达对Hela细胞Nestin的影响 4.4细菌侵袭试验分析E.。011 Kl对稳定转染iboB基因的Hela细胞的 侵袭力变化 5 IbeB蛋白的稳定表达影响Hela细胞微丝变化的分子机制研究 5.1重组质粒pEGFPNI一ibeB的构建 5.1.1常规方法提取E.。011 Kl细菌DNA 5.1.2根据iboB基因的基因序列,考虑定向克隆的需要,分别设计带有 接头序列的上游引物和下游引物,从E.。011 KI细菌DNA中利用PCR技术 扩增ibeB基因ORF 5.1.3将ibeB基因ORF定向克隆至pEGFP一Nl,命名为pEGFPNI 一ibeB 5.1.4通过在多克隆位点两端进行测序,验证pEGFPNI一动。B读码框 的正确性 5.1.5利用杭州维特洁公司的无内毒素型超纯质粒DNA中量制备试 剂盒,提取无内毒素型质粒DNA,准备转染 5


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