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应用短扩增子ASPCR技术对FFPET进行SNP基因分型的研究

谭卓毅  
【摘要】: 前言 福尔马林固定石蜡包埋组织(Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissues,FFPET)是病理学、法医病理学等学科进行疾病诊断和科学研究的常用检材,多被长时期的保存而成为一种重要的个人实物档案,为解决涉嫌保险欺诈、医疗纠纷、财产继承等民事或刑事案件提供了一种极为重要的、可靠的法医物证检材。基于CODIS系统13个STR位点的Plus和Cofiler等试剂盒,虽已广泛应用于血液、唾液、上皮组织、发根及骨组织的基因分型,但是对FFPET进行基因分型时,常因组织固定过程中各种理化因素的影响致使DNA高度降解,从而难以获得稳定、可靠的分型结果。 研究表明,福尔马林固定时间、切片厚度以及不同的脱蜡方法均可影响FFPET提取DNA的质量,从而影响其基因分型。通过优化蛋白酶消化条件,精简DNA提取步骤和纯化DNA模板虽能提高DNA纯度和减少DNA额外损伤,但并不能给FFPET的基因分型带来本质的改观;通过增加循环次数或采用巢式PCR等对PCR方法进行调整与改良,可以提高扩增产物量或扩增特异性,但并未明显改善其检出率。因此,越来越多的学者将研究的重点转移到如何有效地缩短扩增产物片段长度,以克服FFPET检材中DNA严重降解对基因分型的影响,从而提高FFPET基因分型的成功率。各大公司竞相研发出扩增片段较小的miniSTR商品化检测试剂盒,提高了对降解DNA检材的分型成功率,但仍然普遍存在诸如等位基因或位点丢失、不平衡峰、伪峰等问题,影响了在实际检案中的应用。 单核苷酸多态性(Single Nucleotide Po]ymorphism,SNP)具有数量丰富、突变率低、适合高通量自动化检测的特点,被认为是更具应用前景的第三代法医学遗传标记。由于SNP基因座的检测对检材DNA的完整性要求不高,50~100bp的DNA片段就可以满足其分型的需要,从而为解决FFPET基因分型的难题提供了新的思路和途径。 本研究以保证扩增产物片段长度小于100bp为基本条件,针对具有较高杂合度的SNP基因座(rs1454361)自行设计等位基因特异性引物,建立了检测rs1454361基因座多态性的等位基因特异性扩增(Allele Specific PCR,ASPCR)方法,调查了rs1454361基因座在辽宁汉族群体的频率分布;通过rs1454361基因座与D8S1179基因座对FFPET检材基因分型结果的比较,探讨采用短扩增子ASPCR技术对FFPET进行SNP分型的可行性与优越性,进而为解决此类高度降解DNA检材的基因分型问题开拓一种新的途径。 材料与方法 1、选取3具冰冻尸体,分别取肺、骨骼肌、脑组织块按常规方法制作FFPET样品,同时取尸体心脏血液各2ml作为阳性对照;152例中国辽宁地区汉族无血缘关系个体血样。 2、采用短扩增子ASPCR技术建立rs1454361基因座分型系统,检测该基因座在中国辽宁地区汉族群体样本中的多态分布,直接计数法计算其基因型频率与等位基因频率,并进行Hardy—Weinberg平衡检验。采用PowerStatesV12软件计算其法医学应用指标。 3、采用紫外分光光度计与琼脂糖凝胶电泳对FFPET样本的DNA进行质量检测。 4、分别应用短扩增子ASPCR技术与PCR-STR技术对FFPET检材进行基因分型,并对两者的分型成功率与分型效果进行比较。 结果 1、152例中国辽宁地区无血缘关系个体中:TT、TA和从三种基因型频率分别为0.2632、0.4671和0.2697;等位基因T的频率为0.4967,A为0.5033。采用x~2检验法进行Hardy-Weinberg平衡检验的结果为:x~2=0.657(P>0.05)。采用PowerStatesV12软件统计分析结果:其杂合度为(H)0.467,个人识别几率(DP)为0.640,偶合几率(Pm)为0.360,非父排除率(PE)为0.160,多态信息含量(PIC)为0.375。 2、采用紫外分光光度计对FFPET样品进行检测,其OD_(260)/OD_(286)均分布在1.6~1.8。4张切片组的DNA模板浓度约140μg/ml~1g/ml,1张切片组的DNA模板浓度约20~80μg/ml。 3、琼脂糖凝胶电泳显示,FFPET的DNA片段长度主要分布于200bp以下,其中肺脏与骨骼肌FFPET样品的DNA在100bp附近有显亮条带,部分脑组织FFPET样品的DNA降解程度更加严重,片段长度主要分布于50bp以下。另外,在上样量相同的情况下,1张切片组DNA谱带的荧光强度明显低于4张切片组。 4、本研究共18个FFPET样品。所有FFPET样品的PCR—STR(D8S1179基因座)分型结果均无法正确判型,而采用短扩增子ASPCR技术(rs1454361基因座)分型后,4张切片组正确检出率为7/9;1张切片组的正确检出率为4/9。其中,脑组织来源FFPET样品的正确检出率较低,仅4张切片组中有一例正确检出。 结论 1、福尔马林固定7天的FFPET样品提取的DNA高度降解,其片段长度主要分布在200bp以下,集中于100bp左右。选用目的片段较长(>150bp)的STR基因座对其进行PCR-STR分型时,难以分型成功。 2、短扩增子ASPCR技术在对FFPET之类高度降解DNA检材的基因分型方面,具有较高的检出成功率,其效果明显优于PCR-STR技术。 3、rs1454361基因座在中国辽宁汉族群体中具有良好的多态性分布,在法医学上具有较高的应用价值。


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