收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

脊髓谷氨酸转运体在小鼠癌痛发病机制中的作用的研究

夏小萍  
【摘要】: 脊髓谷氨酸转运体在小鼠癌痛发病机制中的作用 目的 谷氨酸转运体通过精确调节细胞外谷氨酸的浓度而在中枢痛觉传导通路中扮演着非常重要的角色。在慢性神经病理性疼痛形成和维持过程中GT的表达和分布可发生显著的变化,表现出双向调节的特点,早期升高,后期下降。由于癌痛脊髓的神经化学改变的独特性,特别是脊髓星形胶质细胞的改变与神经病理性疼痛显著不同,在癌痛的形成和维持过程中谷氨酸转运体的表达是否会有类似的变化,至今尚无相关文献报道,所以研究癌痛的成因中的GT的变化,特别是针对不同GT亚型的变化进行研究很有意义。 本研究拟在小鼠骨癌痛模型上①通过行为学、放射学、病理学等方法,建立并评价小鼠骨癌痛模型。②通过Western Blot方法观察脊髓不同亚型谷氨酸转运体在脊髓的表达,探讨不同亚型的谷氨酸转运体在骨癌痛成因中的作用。③应用非特异性GT激活剂Riluzole,观察对骨癌痛小鼠痛阈的影响,为临床上选择癌痛的治疗药物提供理论依据和新的思路。 实验材料 1、实验动物 健康雄性C3H/HeJ小鼠,体重20~25g,由上海实验动物中心提供。 2、主要试剂和仪器 NCTC2472溶骨性纤维肉瘤细胞(ATCC,美国),NCTC135培养基(Sigma公司,美国),Riluzole购自美国Superior公司,von Frey纤毛(Stoelting公司,美国),兔抗EAAT1抗体、羊抗EAAT2抗体、羊抗EAAT3抗体(美国Santa Cruz公司),小牛抗羊二抗-HRP(美国Santa Cruz公司),小牛抗兔二抗IgG-HRP(美国Santa Cruz公司),ECL液(美国Santa Cruz公司),BME-410A热痛刺激仪(医学科学院生物工程研究所,中国),微量进样器(上海,中国),垂直电泳仪(美国Bio-Band公司),转移槽(美国Bio-Band公司),低温离心机(日本HITACHI),酶标仪(日本Shimadazu公司)。 实验方法 一、小鼠骨癌痛模型的建立和评价 1、动物模型的制备 按Schwei等报道的方法建立小鼠骨癌痛模型。肿瘤细胞购自美国ATCC,以NCTC135培养基培养,每周传代1-2次。戊巴比妥钠(50 mg/kg,i.p.)麻醉小鼠后行右膝关节切开术,在股骨内外髁之间穿刺,将含2×10~5个NCTC2472细胞的20μl的最小必需培养基(a-minimal essence media,α-MEM)注入股骨远端骨髓腔中。对照组也行右膝关节切开术,但是不接种肿瘤细胞,即只注入不含有肿瘤细胞的20μl的α-MEM。接种肿瘤细胞后以牙科合金封闭穿刺孔。大量生理盐水冲净切口。术毕小鼠置于22℃恒温,12h明/暗交替的动物房中饲养,自由取食和饮水。 2、动物分组 40只C3H/HeJ小鼠随机分为2组(n=20):对照组(Sham组)和癌痛组(Sarcoma组)。分别于注射前、注射后1、3、5、7、10、14、21、28天观察小鼠的体重和痛行为学的变化。痛行为学包括以自发缩足反射次数测量自发痛敏、以von Frey细丝刺激足底测量机械缩足阈值(MWT)、热辐射缩足反射潜伏期(PWL)测量热痛敏以及对小鼠行走时后足的使用进行评分。分别于注射前、注射后7、10、14、21、28天进行X线检查评估股骨破坏程度。28天后取股骨进行组织切片,HE染色光镜下观察肿瘤组织和骨结构破坏情况。 3、统计学处理 计量资料以均数±标准差((?)±s)表示,应用SPSS 13.0统计软件进行统计分析。组间比较采用t检验。P<0.05认为差异有统计学意义。 二、骨癌痛小鼠脊髓不同亚型谷氨酸转运体的表达 1、骨癌动物模型的建立 同前。 2、动物分组 35只C3H/HeJ小鼠随机分为2组:假手术组(sham组,n=5)和骨癌痛组(Ca组,n=30)。Ca组分别在右股骨注射肿瘤细胞后1d、3d、7d、10d、14d、21d处死小鼠取同侧腰段脊髓,Sham组直接取腰段脊髓。采用Western blot方法分别测定三种不同亚型EAAT1、EAAT2、EAAT3在脊髓的蛋白表达。 3、统计学处理 数据均以均数±标准差表示,所得数据经SPSS13.0软件处理,组内比较用t检验,组间比较用单因素方差分析(ANOVA),P<0.05认为有统计学差异。 三、谷氨酸转运体激活剂Riluzole对骨癌痛小鼠痛阈的影响 1、癌痛动物模型的建立 同第一部分。 2、动物分组 56只小鼠随机分为6组,假手术组(Sham组,n=6);DMSO组(D组,腹腔内注射Riluzole的溶剂10%DMSO 10ml/kg,n=10);骨癌痛组(Ca组,于癌痛模型建立后第10天开始腹腔内注射10%DMSO 10ml/kg,n=10);Ca+Riluzole5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg组,于癌痛模型建立后第10天开始腹腔内分别给予各个剂量的Riluzote,体积均为10ml/kg,连续使用5天,每天2次,直到第14天为止。分别测定注射肿瘤细胞后14、17、20天小鼠自发痛敏、行走后足使用评分、MWT和PWL。 3、统计学处理 数据均以均数±标准差表示,所得数据经SPSS13.0软件处理,组内比较用t检验,组间比较用单因素方差分析(ANOVA),P<0.05认为有统计学差异。 实验结果 一、小鼠骨癌痛模型的建立和评价 1、小鼠体重的变化 在注射后第28天模型组小鼠的体重与基础值(base)和对照组比较显著下降(P<0.05),而对照组小鼠体重与基础值比较显著增加(P<0.05)。 2、自发缩足反射的次数 两组小鼠在注射(或不含细胞的培养基)之前无明显自发缩足反射,两组之间无显著差异(p>0.05)。模型组小鼠注射肿瘤细胞后自发缩足反射次数逐渐增多,注射后14天较注射前显著增多(P<0.05),并持续增多至第28天。而对照组的次数在注射不含细胞的培养基前后无统计学差异。 3、热缩足反射潜伏期(PWL) 模型组小鼠接种后第14天右后足PWL显著降低,低于术前的基础值(p<0.05),并持续下降至第28天。与对照组比较也有统计学差异(p<0.05)。 4、机械缩足反射阈值(MWT) 接种后第7天开始模型组右后足MWT显著降低,低于术前的基础值(p<0.05),并持续下降至第28天。与对照组比较也有统计学差异(p<0.05)。 5、行走后足使用评分 模型组小鼠右后足使用评分持续降低,第14、21和28天与对照组和基础值比较显著降低(P<0.05)。而对照组第1和3天下降后于第5天恢复到4分,一直持续至第28天。 6、影像学结果 模型组小鼠接种侧股骨出现明显的骨质破坏,随着时间的推移,骨质破坏的程度逐渐加重。第7天的X线片仅见股骨远端有小的病灶,第14天X线显示骨质破坏增多,到第21天骨破坏进一步加重,骨质破坏范围加大,有骨质缺损或骨折出现。第28天骨质完全缺损,肿瘤组织突破骨皮质,能观察到明显的异常软组织影。而对照组股骨X线检查显示28天的观察期内无明显改变。 7、病理改变 光镜下观察显示模型组小鼠注射侧股骨骨髓腔内及骨小梁间被大量肿瘤细胞填充,肿瘤细胞生长活跃。对照组骨髓腔内见各种正常的骨髓细胞,无异常骨结构的改变。 二、骨癌痛小鼠脊髓不同亚型谷氨酸转运体的表达 1、骨癌痛小鼠脊髓谷氨酸转运体EAAT1蛋白的表达 术后第10天骨癌组脊髓EAAT1蛋白含量开始减少,至第14天明显减少,持续降低至术后21天(p<0.01)。 2、骨癌痛小鼠脊髓谷氨酸转运体EAAT2蛋白的表达 术后第10天骨癌组脊髓EAAT2蛋白含量开始减少,至第14天明显减少,持续降低至术后21天(p<0.01)。 3、骨癌痛小鼠脊髓谷氨酸转运体EAAT3蛋白的表达 术后第14天脊髓谷氨酸转运体EAAT3表达下降,持续降低至术后21天(P<0.01)。 三、谷氨酸转运体激活剂Riluzole对骨癌痛小鼠痛阈的影响 与Ca组相比,Riluzole 5 mg/kg、10 mg/kg、20 mg/kg组痛阈均有不同程度的提高(P<0.01),其中20mg/kg提高痛阈的作用可持续至停药后6天。腹腔内注射Riluzole对骨癌痛小鼠的镇痛作用存在剂量依赖效应,Riluzole 20mg/kg i.p.>10mg/kg i.p.>5 mg/kg i.p.。 结论 1、小鼠股骨注射NCTC2472肿瘤细胞可引起骨癌痛小鼠自发痛、触诱发痛、热痛觉过敏以及机械痛敏等痛行为学改变,影像学和病理学检查表明小鼠骨癌痛模型成功建立。 2、骨癌痛小鼠脊髓谷氨酸转运体蛋白表达随着病程的发展逐渐下降,表明脊髓谷氨酸转运体参与了小鼠骨癌痛的形成。 3、腹腔内注射Rituzole可提高癌痛小鼠的痛阈,减轻痛觉过敏现象,并存在剂量依赖效应关系。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 李善华,卞丽香,吉孟香;济南市护理人员癌痛知识调查分析[J];山东医科大学学报(社会科学版);2000年04期
2 E.Heidemann,胡国清;癌痛的治疗[J];The Chinese-German Journal of Clinical Oncology;2000年02期
3 杜华,严小蓉;影响癌痛治疗因素的分析及对策[J];现代护理;2001年03期
4 南方;外治癌痛方药集[J];家庭中医药;2003年04期
5 倪家骧;癌痛的介入治疗[J];中国疼痛医学杂志;2004年04期
6 李佩文;中药防治癌痛前景广阔[J];实用中医内科杂志;1994年04期
7 田维君,宋祥玖,罗宇;癌痛的中医治疗概述[J];武警医学;1994年05期
8 党文,杨介宾;针刺治疗胃癌痛的临床研究[J];中国针灸;1995年S2期
9 秦子河;癌症疼痛内外治疗68例[J];江西中医药;1995年S2期
10 徐建华,侯媛淑;曲马多对癌痛的临床镇痛效果观察[J];中国医师杂志;1996年08期
11 刘德生;如何提高“三级阶梯止痛法”的疗效与安全[J];实用疼痛学杂志;1997年04期
12 闫爱兰,闫玉红;癌痛散合补原汤治疗癌性疼痛46例临床观察[J];中原医刊;2000年03期
13 何玉梅,贾立群;中药外治法在癌痛治疗中的应用[J];中日友好医院学报;2000年02期
14 周庭礼;癌痛病人使用麻醉性镇痛药的误区分析[J];中国药物滥用防治杂志;2003年04期
15 林铎;针灸治疗癌痛举要[J];中医药学刊;2004年03期
16 席宁;癌症疼痛处理的新观点(下)[J];四川肿瘤防治;1995年01期
17 杨德恕,杨建东;痛点阻滞加硬膜外注入吗啡对癌痛镇痛[J];天津医药;1997年11期
18 林小武;癌性疼痛的中医药治疗近况[J];华夏医学;1998年05期
19 张广超,王瑛,阎杰,赵强,曹嫣娜,李璋林;儿童癌痛评价及治疗的临床研究[J];中国肿瘤临床;2002年12期
20 冯潭溪,杨东红;对基层医院加强癌痛控制教育的必要性和紧迫性[J];现代肿瘤医学;2003年03期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 陈伟;韦若梨;;癌痛控制的现状与体会[A];第六届中国癌症康复与姑息医学大会大会论文集和专题讲座[C];2010年
2 罗健;李倩;;关于中国癌痛综合治疗与药物治疗进展及发展的几点思考[A];第六届中国癌症康复与姑息医学大会大会论文集和专题讲座[C];2010年
3 杨萍;孙丽秋;路潜;庞冬;金三丽;丁玥;;癌痛病人生活质量状况及其相关因素研究[A];中华医学会肿瘤学分会第七届全国中青年肿瘤学术会议——中华医学会肿瘤学分会“中华肿瘤 明日之星”大型评选活动暨中青年委员全国遴选论文汇编[C];2011年
4 戴宇翃;于世英;;癌痛患者焦虑抑郁的筛查及相关因素的初步调查[A];第七届全国癌症康复与姑息医学大会大会论文集和专题讲座[C];2011年
5 付兰香;;止癌痛怎么样正确用药[A];河南省手术室护理学术会议暨围手术期安全护理高级研修班论文集[C];2009年
6 ;北京市癌痛状况调查[A];第七届全国癌症康复与姑息医学大会大会论文集和专题讲座[C];2011年
7 张弓;;2010年NCCN成人癌痛临床实践指南解读[A];湖北省第21届肿瘤学术大会论文汇编[C];2011年
8 缪雪蓉;;Nav1.8在骨癌痛大鼠双侧背根神经节神经元上表达降低[A];2010中华医学会全国麻醉学术年会论文汇编[C];2010年
9 李玉芬;;50例癌痛病人家庭用止痛药的调查与护理[A];全国肿瘤护理学术交流暨专题讲座会议论文汇编[C];2002年
10 魏青;王昆;;丁丙诺啡含片治疗晚期癌痛初始剂量的临床疗效观察[A];第四届全国康复治疗学术大会论文摘要汇编[C];2004年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 王丽娜;脑源性神经营养分子在大鼠骨癌痛中的作用及其神经免疫机制[D];苏州大学;2012年
2 杭黎华;大鼠脊髓TDAG8及其下游信号通路在骨癌痛中的作用[D];苏州大学;2013年
3 潘海莉;大鼠骨癌痛外周机制的研究:溶血磷脂酸调制TRPV1电流及其信号通路分析[D];复旦大学;2010年
4 高连印;癌痛消对肝细胞癌缺氧微环境细胞因子HIF-1α、VEGF及PHD2的调节作用的研究[D];湖南中医药大学;2014年
5 段锴铮;初级感觉神经元A型电压门控钾离子通道参与大鼠骨癌痛和双氯芬酸镇痛的机制研究[D];复旦大学;2011年
6 刘灵慧;丘脑中央中核毁损治疗癌症顽痛的实验和临床研究[D];南方医科大学;2007年
7 陆智杰;蛋白酶活化受体2在胰腺癌痛发生机制中的作用研究[D];第二军医大学;2008年
8 陈莎莎;重构型自发活化Caspase3基因的构建及其在骨癌痛大鼠的镇痛效应研究[D];华中科技大学;2010年
9 毛应启梁;大鼠脊髓胶质细胞在癌痛中的功能活动变化及电针缓解癌痛作用观察[D];复旦大学;2007年
10 黄峰;基于“治未病”思想的癌痛消方防治大鼠诱导性肝癌的实验研究[D];湖南中医药大学;2013年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 董文艳;骨转移瘤患者放疗缓解癌痛的程度与α-唾液淀粉酶活性的相关性研究[D];山东大学;2011年
2 赵倩倩;胫骨癌痛大鼠痛觉敏化的形成及其脊髓机制[D];山东大学;2012年
3 肖柳;癌痛贴毒性实验及三种剂型的临床研究[D];湖北中医药大学;2012年
4 何文胜;补体C3在大鼠骨癌痛中的作用及其机制[D];华中科技大学;2013年
5 梅喜;NR2B在骨癌痛小鼠的前扣带回和脊髓中的分布与表达[D];中南大学;2010年
6 柴玫;脑下垂体阻滞治疗癌痛和非癌顽痛效果与内分泌变化相关性的临床研究[D];延边大学;2004年
7 孙艳;MCP-1/ERK信号通路参与骨癌痛的作用机制[D];苏州大学;2013年
8 吴裕超;加巴喷丁联合阿片类药物应用于癌痛的临床研究[D];广西医科大学;2009年
9 程乐;阿片类药物对晚期中重度癌痛患者生存影响的临床研究[D];广西医科大学;2009年
10 李高杨;中药镇痛Ⅰ号外用辅助三阶梯止痛方案治疗中重度癌痛的疗效研究[D];广州中医药大学;2006年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 中国医学科学院肿瘤医院 罗健博士;认识癌痛[N];北京日报;2001年
2 湖南省肿瘤医院 赵江洪 王明德;癌痛需要综合治[N];大众卫生报;2002年
3 魏文;“无痛过年”推广癌痛规范化处理[N];工人日报;2009年
4 本报记者 白毅;癌痛用药莫怕“成瘾”[N];中国医药报;2009年
5 吴世凯;治疗老年癌痛患者更要重视合理用药(一)[N];农村医药报(汉);2009年
6 解放军307医院乳癌科 吴世凯;治疗老年癌痛患者更要重视合理用药[N];中国医药报;2009年
7 本报记者 邹左功;别让癌痛走近[N];健康报;2001年
8 本报记者 衣晓峰 通讯员 李华虹 刘乙辉;对抗癌痛 提高生活质量[N];中国中医药报;2008年
9 天津市肿瘤医院除痛科主任 王昆 整理 李运红 胡颜;癌痛和肿瘤应同步治疗[N];健康报;2008年
10 中日友好医院全国疼痛诊疗研究中心博士 司马蕾;关注癌症及癌痛相关性疲劳[N];中国老年报;2008年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978