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核因子(NF)-κB乙酰化对神经型一氧化氮合酶(nNOS)基因表达的调控

李英慧  
【摘要】: 核因子(NF)-κB乙酰化对神经型一氧化氮合酶(nNos)基因表达的调控 前言 一氧化氮(NO)作为神经递质、神经调节因子和细胞内信号分子,在神经系统中发挥多种重要的生物学功能,然而NO合成水平的失调可启动神经毒性机制,从而引发神经系统疾病。因此组织NO水平对维持神经系统正常的生理功能具有重要意义。NO由左旋精氨酸(L-Arginine)在三种一氧化氮合酶(NOS)催化下产生,包括神经型(nNOS)、诱导型(iNOS)和内皮型(eNOS),其中nNOS广泛存在于神经系统中并参与神经系统的多种生理及病理过程。nNOS基因转录水平的调节对nNOS催化的NO合成至关重要,因此大量的研究集中在各种生理及病理刺激对nNOS表达水平的调节。nNOS基因转录调控极为复杂,因为该基因共有12种不同第一外显子(1a-11),从而产生12种不同转录本,不同转录本的表达谱受各自特异性启动子活性的调节。外显子1f在脑组织中具有相对高的表达。 乙酰化在多种基因表达调控中发挥重要作用,两类作用相反的酶,即组蛋白乙酰转移酶(HAT)和组蛋白去乙酰化酶(HDAC)参与调节蛋白质乙酰化状态。p300是一种具有HAT活性的转录辅激活因子。曲古抑菌素A(TSA)能够特异性抑制HDAC活性,并在转录过程中募集HAT,使组蛋白和转录相关因子乙酰化,从而改变蛋白质的多种生物学特性,以参与基因表达调控。其中核因子(NF)-κB就是一个重要的可受乙酰化修饰的转录因子家族,它包括p65、p50等五种亚基。 迄今为止尚无有关蛋白质乙酰化对nNOS基因表达调控的报道。本研究以TSA为乙酰化作用因素,探讨了乙酰化对人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞中nNOS基因表达的调控作用,证明了TSA引起的NF-κB乙酰化对nNOS 1f启动子活性的影响是乙酰化调节nNOS表达的一种机制,并进一步研究了p300在TSA对NF-κB乙酰化水平调节中的作用。 材料与方法 一、实验材料 1、人神经母细胞瘤细胞系SK-N-SH 2、Real-time RT-PCR及Nuclear run-off实验相关试剂 3、Western印迹杂交相关试剂及NO特异性荧光染料DAF-2 DA 4、基因克隆及萤光素酶报告基因检测相关试剂 5、电泳泳动迁移实验(EMSA)、染色质免疫沉淀(ChIP)及免疫沉淀(IP)相关试剂 二、实验方法 1、Real-time RT-PCR方法检测TSA刺激前后总nNOS及外显子1f特异性nNOS转录本mRNA表达水平的变化;Nuclear run-off方法检测TSA对nNOS基因转录效率的影响。 2、Western印迹杂交检测TSA对nNOS蛋白表达水平的作用;DAF-2 DA荧光染色检测TSA对nNOS催化的NO合成水平的影响。 3、应用软件分析nNOS 1f启动子结构;并构建系列截短的nNOS 1f启动子萤光素酶报告基因载体,应用双萤光素酶检测系统分析各段启动子的活性。 4、EMSA方法体外鉴定nNOS 1f启动子区NF-κB反应元件及TSA对NF-κB与该元件结合力的影响;ChIP实验进一步在体内条件下验证NF-κB与该位点的结合及TSA对这种结合的作用。 5、应用NF-κB p65及p50亚基特异性抗体进行免疫沉淀,并应用抗乙酰化赖氨酸单克隆抗体为一抗进行Western印迹杂交,检测TSA对p65及p50乙酰化水平的调节作用。 6、双萤光素酶报告基因检测系统鉴定NF-κB反应元件在TSA对nNOS 1f启动子活性调节中的作用。 7、应用免疫共沉淀方法,分别采用p65、p50或p300抗体进行免疫沉淀,并相应使用p300或p65、p50抗体为一抗进行Western印迹杂交,检测p300与NF-κB p65、p50亚基的相互作用及TSA对这种作用的影响;应用p300特异性抗体进行ChIP实验,检测p300与染色质NF-κB反应元件区域的结合及TSA对其的作用;采用Western印迹杂交检测TSA对p300表达水平的影响。 8、细胞转染野生型或HAT结构域缺失的突变型p300表达载体后,以p300抗体进行免疫沉,抗乙酰化赖氨酸抗体为一抗进行Western印迹杂交,检测p300对NF-κB的乙酰化作用及TSA对这种作用的影响。 结果 1、Real-time RT-PCR结果证明外显子1f特异性转录本为SK-N-SH细胞中nNOS基因最主要的转录本,同时TSA以时间及浓度依赖方式上调总nNOS及外显子1f nNOS mRNA表达水平;nuclear run-off实验证明TSA使nNOS转录效率提高。 2、Western印迹杂交及DAF-2 DA荧光检测显示TSA使SK-N-SH细胞中nNOS蛋白及nNOS催化的NO合成水平显著增加。 3、软件分析发现nNOS 1f启动子内存在一些潜在的受乙酰化修饰的转录因子结合位点;萤光素酶报告基因检测在启动子内发现两个正调控区和两个负调控区。 4、EMSA实验在体外条件下证明了nNOS 1f启动子-893~-884区为NF-κB反应元件,并且TSA使NF-κB p65及p50亚基与该位点结合增强;ChIP实验进一步在体内条件下获得了相同的结果。 5、免疫沉淀结合Western印迹杂交在基础状态下观察到了NF-κB p65及p50亚基的乙酰化,并且TSA可上调二者乙酰化水平。 6、应用萤光素酶报告基因系统证明了本实验所鉴定的NF-κB反应元件是nNOS 1f启动子中一个强大的正调控元件,同时它在TSA引起的nNOS 1f启动子的转录激活中发挥重要作用。 7、免疫共沉淀结果显示细胞核中p300与NF-κB p65及p50亚基之间存在相互作用,TSA可加强二者间的作用;ChIP结果提示p300参与结合nNOS 1f启动子NF-κB反应元件,TSA可募集p300至该区域;Western印迹杂交显示TSA能够上调p300蛋白表达水平。 8、免疫沉淀结合Western印迹杂交显示p300能够直接乙酰化NF-κB p65及p50亚基,并且TSA使p300的作用增强。 结论 1、nNOS 1f启动子-893~-884区为NF-κB反应元件。 2、TSA通过增强p300与NF-κB p65及p50亚基在nNOS 1f启动子NF-κB反应元件区的相互作用,而加强p300对p65和p50的乙酰化,进而增强NF-κB的DNA亲和力以引起nNOS 1f启动子转录激活,这是TSA上调nNOS mRNA和蛋白表达水平及nNOS催化的NO合成的机制之一。 3、HNOS外显子1f特异性转录本为SK-N-SH细胞中nNOS基因最主要的转录本。


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