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钙调蛋白对豚鼠心室肌细胞Cav1.2钙通道的剂量依赖性和钙依赖性作用

韩冬云  
【摘要】: 钙调蛋白对豚鼠心室肌细胞Cav1.2钙通道的剂量依赖性和钙依赖性作用 前言 电压门控型L型钙通道是介导钙离子进入细胞内的重要途径,进而导致细胞内多种钙依赖性调控过程的发生,如兴奋产生、肌肉收缩、激素和神经递质的分泌及基因表达等。L型钙通道的一个重要特征是rundown,主要表现为细胞膜被破坏后通道活性的丧失,在inside-out的膜片中比较容易观察到rundown。本课题组近期实验表明钙调蛋白(Calmodulin,CaM)和三磷酸腺苷(ATP)是能够逆转钙通道rundown的重要活性因子。 CaM是广泛存在于细胞内的一种重要的钙结合蛋白,在心肌细胞,它可以直接或间接调节心肌兴奋收缩偶联以及其它重要的生理过程。心脏L型钙通道(Cav1.2)是CaM作用的重要靶点,通过与钙通道α_1亚单位的C末端结合来介导钙依赖性失活(Ca~(2+)-dependent Inactivation,CDI)和钙依赖性激活(Ca~(2+)-dependent Facilitation,CDF)两个不同的过程。 近年的研究提示CaM与L型钙通道的直接结合是介导CDI和CDF的首要步骤。CaM在细胞内以两种形式存在,即无钙CaM(apoCaM)和钙结合型CaM(Ca~(2+)/CAM,包括Ca~(2+)饱和型和非饱和型CaM)。据报道,apoCaM结合于L型钙通道并对通道的CDI和CDF起到Ca~(2+)感受器的作用。CaM对CDI和CDF的双向调节作用提示在L型钙通道C末端可能存在CaM的多个结合位点。目前在提出的数个CaM结合序列中,IQ基序被证实为CDI和CDF所必需的序列。此外,其它序列如A基序、C基序、EF hand和N末端等均可与CaM结合,由此可见,CaM介导的对钙通道调控的分子机制是非常复杂的。 本实验利用膜片钳内面向外模式观测了CaM对L型钙通道的钙依赖性和剂量依赖性作用,进一步揭示其对钙通道调控的分子机制。 方法 1、单一心室肌细胞的制备 健康成年豚鼠一只(体重300~500g),雌雄不限,苯巴比妥钠(30mg·kg~(-1))腹腔注射麻醉后,在人工呼吸机支持下进行主动脉插管。取出心脏,用胶原酶分离豚鼠心室肌细胞,将分离的细胞置于4℃冰箱稳定1h后使用。 2、野生型CaM和突变型CaM_(1234)的制作、提取与纯化 应用RT-PCR方法扩增CaM编码序列并克隆至载体,应用QuickChange突变试剂盒使野生型CaM序列的4个EF-hand基序发生单点突变。使连有CaM和CAM_(1234)序列的质粒载体先后在E.coli XL1-blue和E.coli BL21中高效表达。用IPTG诱导GST融合蛋白的表达,反复冻融方法分离融合蛋白并用GlutathioneSepharose 4B进行纯化。用PreScission protease切去融合蛋白的GST部分得到纯化的目的蛋白。 3、膜片钳记录和数据分析 应用膜片钳单通道记录模式监测钙通道活性。首先形成细胞贴附式并记录电流2min,然后将膜片自细胞游离建立膜内面向外模式。电流记录1min后,将游离膜片小心移入浴槽旁边充满测试溶液的凹槽中,并连续记录电流20min。 利用Ba~(2+)负载记录钙通道电流,通过钙通道的钡电流由从-70至0mV的去极化脉冲引出,波宽200ms,刺激频率0.5Hz,数据经由膜片钳放大器记录后以3.3kHz的采集速率输入计算机,减去漏电流。由于I=N×Po×i,测定实验脉冲开始后5~105ms期间的平均电流(I)并除以单通道电流幅值(i)可获得通道开放频率(NPo),其中N为膜片中的通道数目,Po为通道的平均时间开放概率。 实验结果用均值士标准误表示,数据处理用Student's t检验分析。P<0.05为差异显著。 结果 1、CaM+ATP对钙通道活性的剂量依赖性作用 应用膜片钳细胞贴附模式及膜内面向外模式记录单通道钙电流。当游离Ca~(2+)浓度为100nM时,膜片游离后1分钟给予CaM+ATP可使钙通道活性恢复。与细胞贴附式的NPo相比,低浓度和中等浓度的CaM(0.7,1.4,2.1μM)分别使通道活性达97.5±32.5%(n=6),141.8±40.3%(n=8)和221.6±75.0%(n=9)。但是高浓度的CaM(3.5和7.0μM)却使通道活性恢复较少,分别达对照的64.6±28.3%(n=11)和20.2±11.7%(n=7)。在同一细胞上,2.1μM CaM+ATP能够明显增加通道的活性,但是当给予7.0μM CaM+ATP时却使恢复的通道活性受到了抑制。 2、CaM+ATP对钙通道活性的钙依赖性的作用 在内面向外模式下,同一浓度的CaM对通道活性的作用随钙离子浓度不同而发生变化。当游离Ca~(2+)浓度为0、250和500nM时,1.4μMCaM分别使通道NPo达细胞贴附式的89.6±21.0%(n=7),219.8±71.1%(n=10)和36.0±12.6%(n=7)。 3、rundown时间为1min时CaM对通道的作用与磷酸化及脱磷酸化无关 CaMKⅡ抑制剂KN-62(10μM)以及非特异性蛋白激酶抑制剂K252a(10μM)并不能阻滞CaM对通道的作用,提示了CaM的作用并非由CaMKⅡ和任何其它蛋白激酶所致的磷酸化来介导。在2μMCa~(2+)浓度时,cyclosporinA(1μM)并不影响0.35μM CaM对钙通道活性的作用,提示在高钙浓度时CaM对通道的作用与PP2B介导的脱磷酸化无关。 4、钙离子浓度影响了CaM对通道的亲和力 在一定Ca~(2+)浓度时,激活和失活相比需要较低的Kd值。随着Ca~(2+)浓度的升高,激活和失活的Kd值均降低。这说明Ca~(2+)增强了CaM对通道的亲和力。另外,此结果也说明了通道上有两个独立的效应位点与CaM相互作用并诱导产生不同的调控作用。 5、CaM_(1234)+ATP对钙通道活性的作用 将游离膜片暴露于含有不同Ca~(2+)浓度的CAM_(1234)+ATP测试溶液中,结果显示当游离Ca~(2+)浓度由0增至250nM时,3.5μM CAM_(1234)+ATP诱导的钙通道的活性基本保持不变。与野生型CaM一致的是,当游离Ca~(2+)浓度增至微摩尔水平时,CAM_(1234)诱导的钙通道活性恢复较少,另外,似乎只有失活相出现了钙依赖性左移。因此,高钙状态下通道活性恢复的显著差异以及CAM_(1234)诱导的失活相的左移提示在微摩尔钙浓度时L型钙通道的调控可能存在一个独特的分子机制。 6、等高线图展示了Ca~(2+)和CaM对通道活性的交互作用 从等高线图可以看出通道活性对CaM和Ca~(2+)依赖性的几个显著特征。(1)钙通道活性的产生需要一定浓度的CaM,大约在0.1-10μM范围内。CaM作用峰值的左侧和右侧分别代表激活相和失活相。(2)随着Ca~(2+)浓度的升高,“CaM窗”向左移动(即低浓度侧)。(3)在高钙浓度时,任何浓度的CaM均不能诱导通道活性。 结论 1、CaM可以直接诱导Cav1.2钙通道的激活和失活,而且这种作用是钙依赖性的。 2、Ca~(2+)/CaM对钙通道的作用与磷酸化和脱磷酸化无关。 3、CaM在钙依赖性激活和失活中发挥钙离子感受器作用,四个钙离子结合位点突变的CAM_(1234)取消了钙依赖性激活和失活。 4、Cav1.2钙通道C和/或N末端存在两个独立的作用位点分别介导通道的激活和失活。 5、EF hand基序可能参与了高钙浓度时通道的失活。


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