T淋巴细胞分泌的MIP-1α与人脑微血管内皮细胞膜受体CCR5相互作用：Aβ依赖性促进T淋巴细胞穿过血脑屏障

【摘要】： 目的 血脑屏障是由脑微血管内皮细胞及其间形成的紧密连接、血管基膜和星形胶质细胞的足突构成。它属于一种代谢和生理性屏障结构，将中枢神经系统的微环境与外周循环系统分隔开来。血脑屏障对于维持正常的中枢神经系统功能非常重要，传统观点认为，中枢神经系统是一个免疫赦免器官，正常情况下免疫系统的细胞和分子不能自由进入脑。但是，随着研究的不断进展，人们逐渐认识到，即使在生理状态下，中枢神经系统内也存在免疫监视过程。在很多疾病，如疱疹病毒性脑炎、HIV脑炎、多发性硬化、阿尔茨海默氏病等在病理状态下血脑屏障结构均遭到破坏，外周免疫细胞可以主动进入脑实质而参与炎症反应，从而启动脑内的免疫应答，清除可能会引起脑发生病变的因子。 而其中阿尔茨海默氏病(Alzheimer's disease，AD)是近年来一直研究的热点问题，它是以进行性痴呆为主要症状的大脑变性疾病，是人类中与年龄相关发生认知功能逐渐丧失最常见的一种疾病，它严重影响着老年人的生活质量。因此研究AD的发病机制，探索防治AD的干预靶点，是神经科学的工作重点。 近年来越来越多的证据表明，炎症机制在AD发病中起着至关重要的作用。1994年McGeer和Rogers首先提出AD的神经慢性退行性变可能是脑内免疫和炎症反应不适当激活的结果，超强的免疫反应可方向错误地攻击神经组织而造成细胞损伤和死亡。最近Togo等人发现多数AD患者脑实质内T淋巴细胞数量明显多于其他痴呆患者和同龄对照者。淋巴细胞穿过血脑屏障是一个复杂的过程，淋巴细胞和微血管内皮细胞表面表达的黏附分子及其受体的相互作用发挥了重要作用，但是引起T淋巴细胞数量增多的原因，即促使AD患者外周血中的T细胞穿过血脑屏障的机制并不清楚。本研究室陈誉华课题组在研究AD病人T淋巴细胞穿过血脑屏障机制的过程中，发现AD病人外周血T淋巴细胞穿过血脑屏障体外模型——人脑微血管内皮细胞(Human Brain Microvascular Endothelial Cell，HBMEC)单层的能力显著增高，而且T淋巴细胞的穿过能力显著高于单核细胞，B细胞基本不能穿过。接着表达谱芯片分析结果表明其巨噬细胞炎症蛋白1α(MacrophageInflammatory Protein，MIP-1α)表达明显增高。然而，是否MIP-1α在T淋巴细胞穿过HBMEC单层过程中发挥作用，还未见文献报道。 AD的主要神经病理特征是细胞外存在大量由β淀粉样蛋白(beta-amyloid protien，Aβ)组成的老年斑(senile plaques，SP)、神经细胞内的神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles，NFT)、神经元缺失、以及皮质动脉和小动脉的血管淀粉样变性。而β淀粉样蛋白在脑内的沉积是AD发病的早期过程和中心环节。Aβ的沉积能活化脑内具有吞噬活性的小胶质细胞，引起先天性免疫应答。 基于此，本文选择6T-CEM细胞作为AD病人T淋巴细胞的模式细胞，着重探讨了MIP-1α-CCR5相互作用在AD病人T淋巴细胞穿过血脑屏障过程中所发挥的生物学功能，同时通过建立Aβ脑内沉积动物模型，发现注射至大鼠海马的Aβ_(1-42)能够诱导外周血T细胞MIP-1α依赖性进入脑实质，最后通过体外小胶质细胞原代培养对T淋巴细胞和小胶质细胞之间的“交流”进行了初步探讨，为进一步研究T淋巴细胞在AD病人脑内发挥的作用以及对AD的治疗提供了理论基础。 方法 一、探讨MIP-1α在T淋巴细胞(6T-CEM)穿过HBMEC单层过程中的作用 1、细胞培养 (1)HBMEC细胞培养于含10％胎牛血清，10％Nu血清的RPMI1640培养液。 (2)6T-CEM细胞培养于10％新生牛血清的RPMI1640培养液。 2、免疫荧光技术检测紧密连接蛋白ZO-1表达 (1)6T-CEM以时间方式或rhMIP-1α以时间和浓度方式与HBMEC共同孵育后，通过免疫荧光法观察紧密连接蛋白ZO-1分布。 (2)6T-CEM、MIP-1α中和抗体与HBMEC共同孵育后检测紧密连接蛋白ZO-1分布。 3、跨内皮迁移实验分析6T-CEM穿过HBMEC单层能力及HBMEC单层通透性研究 (1)6T-CEM与不同浓度的rhMIP-1α加入BBB体外模型Transwell上室作用20h后，计数穿过进入Transwell下室的细胞数。 (2)6T-CEM与不同浓度的MIP-1α中和抗体加入BBB体外模型Transwell上室作用20h后，计数穿过进入Transwell下室的细胞数。 (3)Transwell上室中加入相同浓度rhMIP-1α，分别孵育不同时间，或者加入不同浓度的rhMIP-1α孵育6h，测定跨上皮细胞电阻(Trans Epithelial Electrical Resistance，TEER)，然后通过加入辣根过氧化物酶(HRP)进行HRP flux分析。 二、探讨HBMEC膜受体CCR5在6T-CEM穿过HBMEC单层过程中的作用 1、应用Western blot方法分析不同处理因素下HBMEC细胞膜上CCR5受体及ROCK激酶表达 (1)6T-CEM与HBMEC分别孵育不同时间后，检测HBMEC膜受体CCR5表达。 (2)rhMIP-1α以浓度和时间方式与HBMEC作用后，检测HBMEC膜受体CCR5表达。 (3)rhMIP-1α与HBMEC分别孵育不同时间后，或rhMIP-1α作用于分别经过CCR5中和抗体2D7和ROCK特异性抑制剂Y27632处理的HBMEC后，检测HBMEC中cofilin磷酸化情况。 (4)Aβ以浓度与时间方式与HBMEC作用后，检测HBMEC膜受体CCR5表达。 2、真核表达载体构建及稳定细胞转染方法建立高表达CCR5的HBMEC细胞株 (1)重组质粒pUCmT-CCR5的构建 ①以CCR5的基因序列，依据引物设计原则设计引物，PCR扩增HBMEC中CCR5基因片断。 ②T-A克隆将CCR5基因片段连接到pUCmT载体上，命名为pUCmT-CCR5。 ③将重组质粒pUCmT-CCR5转化感受态细菌DH5α，通过蓝白筛选，酶切鉴定，验证插入片段的存在。 ④送交测序，验证插入片段序列的正确性。 (2)真核表达载体构建 ①提取pUCmT-CCR5(含有CCR5基因)和Invitrogen公司载体pcDNA3.1／Myc-HisA质粒DNA，将CCR5基因全长(1kb)定向克隆至pcDNA3.1／Myc-HisA，命名为pcDNA3.1／MH-CCR5。 ②双酶切验证克隆是否成功，将pcDNA3.1／MH-CCR5送交测序，验证CCR5基因读码框的正确性。 ③利用Qiagen Midi rep质粒DNA中量提取试剂盒，分别提取pcDNA3.1／Myc-HisA和pcDNA3.1／MH-CCR5质粒DNA。 (3)稳定转染HBMEC细胞 ①利用Fugene~(TM) 6 transfection reagent，对HBMEC进行转染，通过10-14天的G418筛选，挑取单克隆，扩大培养，形成能够稳定传代的细胞克隆株。 ②利用CCR5的抗体，通过Western blot方法检测CCR5蛋白的表达，以此来鉴定转染成功的单克隆细胞株。 3、免疫荧光技术检测紧密连接蛋白ZO-1表达 6T-CEM与CCR5中和抗体2D7预处理的HBMEC共同孵育后检测紧密连接蛋白ZO-1分布 4、跨内皮迁移实验分析6T-CEM穿过HBMEC单层能力 (1)6T-CEM细胞加入BBB体外模型已形成HBMEC(CCR5+)单层的Transwell上室作用20h后，计数穿过进入Transwell下室的细胞数。 (2)6T-CEM细胞加入到经CCR5中和抗体2D7预处理的BBB体外模型Transwell上室作用20h后，计数穿过进入Transwell下室的细胞数。 5、双重免疫荧光技术观察HBMEC膜受体CCR5和MIP-1α的定位 三、探讨大鼠脑内Aβ_(1-42)沉积对T细胞迁移入脑的影响 1、Aβ_(1-42)脑内沉积动物模型的建立及标本采集与处理 (1)制备聚集态Aβ_(1-42)和Aβ_(42-1)，通过立体定位仪将Aβ_(1-42)注射到Wistar大鼠双侧海马，对照组注射等体积Aβ_(42-1)和PBS。 (2)标本采集与处理 ①心脏采血，肝素抗凝。 ②经左心室依次灌注生理盐水和4％多聚甲醛，立即取脑。 ③脑组织经后固定和蔗糖溶液浸泡，冰冻切片机上行冠状切片，片厚10μm。 ④通过NycoPrep~(TM) 1.077 A and MagCellect Rat CD3+T细胞分离试剂按照产品说明书操作规程从肝素化的大鼠全血中分离T淋巴细胞。 ⑤Trizol提取大鼠T细胞总RNA并反转录成cDNA。 2、双重免疫荧光技术观察Aβ_(1-42)沉积对脑微血管内皮细胞膜受体CCR5表达及T细胞穿过血脑屏障的影响 (1)利用vWF和CCR5的抗体，通过双重免疫荧光技术观察脑微血管内皮细胞膜受体CCR5表达。 (2)利用CD3抗体，通过免疫荧光技术观察脑内T细胞分布。 (3)大鼠腹腔注射MIP-1α的中和抗体，观察阻断MIP-1α的效应对T细胞穿过血脑屏障的影响。 3、半定量PCR方法检测Aβ_(1-42)脑内沉积大鼠T淋巴细胞MIP-1α表达情况 四、探讨MIP-1α在Aβ反应性小胶质细胞活化中的作用 1、细胞培养 (1)BV-2培养于10％新生牛血清的DMEM培养液。 (2)大鼠小胶质细胞的原代培养。 2、小胶质细胞的增殖实验 (1)将原代培养的小胶质细胞接种于96孔板中，待细胞长满。 (2)按照实验设计分别加入不同处理因素(详见第四部分方法)。 (3)参考CyQuent试剂盒说明书进行操作。 (4)荧光分光光度计读值。 3、NO释放测定 (1)将原代培养的小胶质细胞接种于96孔板中，待细胞长满。 (2)按照实验设计分别加入不同处理因素。 (3)按照NO释放测定试剂盒说明书进行操作。 (4)酶标仪读值。 4、Aβ吞噬实验 (1)将原代培养的小胶质细胞接种于铺有盖片的24孔板中。 (2)按照实验设计加入不同浓度MIP-1α，同时加入FITC-Aβ作用不同时间。 (3)共聚焦显微镜观察并分析荧光含量。 结果 1、T淋巴细胞分泌的MIP-1α促使其穿过HBMEC单层能力增强 (1)表达MIP-1α的T淋巴细胞(6T-CEM细胞)或rhMIP-1α与HBMEC相互作用后，引起HBMEC间的紧密连接结构紊乱。 (2)rhMIP-1α能够促使6T-CEM穿过HBMEC单层能力增强，而经过MIP-1α中和抗体处理或针对MIP-1αsiRNA干扰后的6T-CEM穿过HBMEC单层能力降低，同时紧密连接结构基本保持完整。 2、HBMEC膜受体CCR5介导了T淋巴细胞穿过HBMEC单层过程 (1)6T-CEM或rhMIP-1α与HBMEC相互作用，均引起HBMEC膜受体CCR5表达升高。 (2)成功构建真核表达载体pcDNA3.1／Myc-HisA-CCR5及稳定表达CCR5基因的HBMEC细胞克隆株。 (3)6T-CEM穿过高表达CCR5的HBMEC单层能力增强，而加入CCR5中和抗体2D7后，6T-CEM穿过HBMEC单层能力降低，并且紧密连接结构基本保持完整。 (4)rhMIP-1α能够与HBMEC细胞膜上的CCR5配体-受体共定位。 (5)MIP-1α-CCR5相互作用通过ROCK信号途径引起紧密连接紊乱。 3、大鼠脑内Aβ_(1-42)沉积诱导T淋巴细胞MIP-1α依赖性迁移入脑 (1)Aβ_(1-42)能够上调HBMEC细胞膜上CCR5受体表达。 (2)成功制备Aβ_(1-42)在脑内沉积的动物模型。 (3)并且在脑内沉积的模型动物中Aβ_(1-42)沉积也能够诱导外周血T淋巴细胞MIP-1α和脑内皮细胞上CCR5表达升高，最终引起外周血T细胞MIP-1α依赖性穿过血脑屏障。 4、MIP-1α不能协同Aβ引起小胶质细胞的活化以及Aβ吞噬 (1)成功进行大鼠小胶质细胞的原代培养以及小鼠小胶质瘤细胞BV2培养。 (2)通过小胶质细胞增殖实验、NO释放实验和Aβ吞噬实验证明，MIP-1α单一因素不能协同Aβ增强小胶质细胞的增殖、NO释放及Aβ吞噬能力。 结论 1、T淋巴细胞分泌的MIP-1α与HBMEC细胞膜上的CCR5受体相互作用，通过激活HBMEC细胞中ROCK信号通路引起紧密连接结构紊乱，导致紧密连接开放，使T淋巴细胞穿过HBMEC单层能力增强。 2、大鼠脑内Aβ_(1-42)沉积能特异性地诱导外周血T细胞中MIP-1α和脑血管内皮细胞膜上CCR5受体的高表达，最终引起外周血T细胞MIP-1α依赖性入脑。 3、T淋巴细胞分泌的MIP-1α不能协同Aβ引起小胶质细胞的活化及Aβ吞噬，但可能与脑内其他因素共同作用参与复杂的免疫反应过程，从而最终完成Aβ清除。