cglI基因复合体在钝齿棒杆菌中的功能和行为研究

【摘要】：cglI基因复合体在钝齿棒杆菌中的功能和行为研究 目的 棒杆菌是工业生产氨基酸的重要菌种。由于发酵生产的规模化和连续性,生产中极易遭受噬菌体污染,严重影响企业生产过程,并给生产企业带来严重经济损失。生产中通常采用改进生产工艺,改善卫生条件,控制生产环节等措施预防噬菌体污染,虽然污染程度有所减轻,但仍时常发生。国内外一直采用菌株诱变的方法筛选抗噬菌体菌株,试图解决生产中的噬菌体污染问题。由于诱变获得的突变株存在生长缓慢,或其它生理性状改变,或生产能力下降,或只针对个别噬菌体有抗性,并易于产生回复突变等问题。所以,很难得到能用于生产的突变株。因此,噬菌体污染问题一直威胁着氨基酸的发酵生产。本文利用基因工程技术,在研究cglI基因复合体在大肠杆菌中克隆的有效方法基础上,通过将含有源自谷氨酸棒杆菌的限制修饰系统cglI基因复合体导入钝齿棒杆菌构建重组菌株,以探索cglI基因复合体用于构建抗噬菌体基因工程菌的可行性,以期从根本上解决氨基酸生产中的噬菌体污染问题。同时,对携带cglI基因复合体的重组质粒的稳定性及其对宿主细胞生长代谢的影响进行了研究。 方法 根据GenBank中cglI基因复合体的基因序列设计PCR引物,并于两端分别引入BamHI酶切位点序列。以谷氨酸棒杆菌CICC10226基因组DNA为模版,常规PCR扩增cglI基因片段,与克隆载体pMD18-T连接,构建重组克隆质粒pMD18-T-cglI。菌落PCR筛选转化子,测序分析克隆的基因片段的碱基组成。BamHI分别酶切重组克隆载体pMD18-T-cglI和棒杆菌穿梭表达载体pJL23,将回收的cglI基因片段和pJL23大片段用DNA连接酶连接,转化大肠杆菌HB101,筛选阳性克隆。制备重组质粒pJL23-cglI,酶切及PCR鉴定cglI基因片段大小和连接方向。大量制备重组质粒pJL23-cglI,电击转化到钝齿棒杆菌中,用含卡那霉素的LB平板筛选阳性克隆。酶切和PCR鉴定重组质粒后,噬菌体感染实验鉴定重组钝齿棒杆菌的功能活性。将构建的重组钝齿棒杆菌在无卡那霉素的LB平板上连续传100次,再从不同传代次数平板上分别挑取100个菌落,分别接种到有和无卡那霉素的LB平板上,测定重组质粒分离稳定性,将不同传代次数的菌落接种到无卡那霉素的LB液体培养基中,利用噬菌体感染实验测定重组质粒的结构稳定性。以野生钝齿棒杆菌做对照,通过测定生长曲线研究含cglI基因复合体的重组质粒对重组钝齿棒杆菌生长的影响;通过谷氨酸含量测定研究含cglI基因复合体重组质粒对重组钝齿棒杆菌代谢的影响。 结果 实验结果表明,以P1/P2为引物,PCR扩增得到了与预期大小一致(2177bp)的基因片段。克隆到载体pMD18-T后,经测序分析表明,克隆的基因片段与已知的cglI基因序列同源性达100%。cglI基因与棒杆菌穿梭表达载体pJL23重组构建的重组表达质粒pJL23-cglI,转化大肠杆菌HB101后,获得了阳性克隆菌株。经酶切和PCR鉴定证实了重组基因片段大小和正向连接方向。实验发现编码单独限制酶的基因在大肠杆菌HB101中表达了功能活性,但cglI基因复合体在大肠杆菌中未表达功能活性。重组表达质粒pJL23-cglI导入钝齿棒杆菌中后构建的重组钝齿棒杆菌经鉴定表明重组基因片段大小和连接方向未发生变化。功能活性研究表明,构建的重组钝齿棒杆菌对其相应的5种噬菌体显示了很强的限制活性,感染重组钝齿棒杆菌的噬菌体在胞内均未增殖。重组质粒pJL23-cglI在钝齿棒杆菌中的稳定性研究结果表明,重组钝齿棒杆菌连续传100代次后,重组质粒在钝齿棒杆菌中的分离稳定性和结构稳定性均达100%,表明重组质粒在钝齿棒杆菌中很稳定。生长曲线测定实验结果表明,与野生钝齿棒杆菌相比重组钝齿棒杆菌达到对数期的时间约延迟一小时左右,但达到稳定期的时间趋于相同。谷氨酸产生量实验结果表明,重组钝齿棒杆菌和野生钝齿棒杆菌在发酵过程中的谷氨酸积累量的变化趋势基本一致,显示了相同的谷氨酸产生高峰,32h的最大产生量分别为277.74mg/L和261.39mg/L,表明重组质粒pJL23-cglI的导入并未影响钝齿棒杆菌的代谢产酸量。 结论 本文以McrBC限制系统缺陷的大肠杆菌HB101作为宿主菌成功克隆了源自谷氨酸棒杆菌的限制修饰系统cglI基因复合体。将含有cglI基因复合体的重组质粒导入钝齿棒杆菌中,成功构建了抗噬菌体重组菌株,证实了cglI基因复合体在钝齿棒杆菌中的抗噬菌体功能活性。携带cglI基因复合体的重组质粒在钝齿棒杆菌中不但具有结构稳定性,而且具有很好的分离稳定性。重组质粒pJL23-cglI导入钝齿棒杆菌虽然对其早期生长有些影响,但并未影响其产生目的产物谷氨酸,进而证实了cglI基因复合体编码的甲基转移酶对宿主基因组DNA胞嘧啶甲基化基本不影响钝齿棒杆菌的生长代谢。本文利用cglI基因复合体构建抗噬菌体菌株,为从根本上解决氨基酸发酵生产中的噬菌体污染问题提供了一种有效方法,同时为cglI基因复合体的进一步应用奠定了理论基础。