卵泡液中NK细胞活化与IVF结局的关系

【摘要】： 实验目的 体外受精-胚胎移植助孕技术是近年来发展起来的一门新兴的助孕技术,随着新药物的开发、临床促排卵方案的成熟以及胚胎培养环境的改善,其临床妊娠率有了明显的提高,但仍徘徊在40%左右,因此众多学者仍在探索着提高临床妊娠率的方法。自然杀伤(NK)细胞是故有免疫系统中一类重要的淋巴细胞,由于其在妊娠调节中的重要作用而受到人们的关注。探讨卵泡液中分泌型NK(CD56~+NK)细胞及活化的CD56~+NK细胞的比例与IVF结局的关系,以此探讨NK细胞在IVF助孕治疗中的作用,为进一步通过调节NK细胞的功能,改善IVF临床妊娠率提供理论基础。 实验方法 一、卵泡液样本采集 选自我院生殖中心2007年7月至2008年1月首次接受IVF助孕治疗的患者,年龄在35周岁以下,近3个月内未应用过激素类药物,不孕原因为单纯输卵管因素或男性因素,既往无自然流产史。患者身体健康,无免疫性疾病史,基础内分泌水平正常。从中选取患者55例,常规长方案促排卵治疗,在取卵日收集取卵时第1和第2个穿刺卵泡的卵泡液,排除含有空卵泡及混血的卵泡液,余30例患者的卵泡液待测。 二、主要试剂及仪器 1、主要仪器: 流式细胞仪(FACSCalibur)、台式离心机、涡旋震荡器,微量移液器(1000μl、100μl、10μl,流式细胞专用试管) 2、检测试剂: Isotype Control(MouseIgG1-FITC/IgG1-PE)、CD69-FITC、CD56-PE、CD3-PerCP、PBS、FACS Lysing Solution红细胞裂解液(10×,使用前用蒸馏水稀释成1×)。 三、实验过程与统计学方法 1、实验过程 (1)将卵泡液以200g离心10分钟,300目滤网过滤后用PBS调成细胞悬液。 (2)取4支流式试管,分别为对照管和实验管,CD56和CD69单阳性管。对照管分别加入20μl MouseIgG1-FITC、MouseIgG1-PE、CD3-PerCP荧光抗体,实验管分别加入20μl CD69-FITC、CD56-PE、CD3-PerCP荧光抗体,CD56和CD69单阳性管分别加入20μl CD69-FITC或20μl CD56-PE。分别取100μl卵泡液细胞悬液加入每支试管中,不要碰到管壁。涡旋混匀,室温避光保存20分钟。 (3)取出试管,每管加入10倍稀释后的1×FACS Lysing Solution 2ml,涡旋混匀,避光5-10分钟。待管内液体透亮后300g离心5min,弃去上清液。 (4)每管加入2ml的PBS,涡旋混匀,300g离心5min,弃去上清液后加入0.5ml PBS混匀,4℃避光1h内上机检测。 (5)样本上流式细胞仪,并用cell quest软件进行分析。进行实验获取条件的调整,先用对照管进行设置,用前向角和侧向角(FSC/SSC)调整确保淋巴细胞清晰显现出来。在FSC/SSC点图设门(R1)为淋巴细胞,调整荧光电压(FL1、FL2)使阴性对照在十字门左下角,在CD3-SSC图中取门G1=R1,并设R2门,为CD3阴性淋巴细胞;在CD56-CD69图中取门G2=Rland R2,设R3门,为CD3阴性、CD56和CD69双阳性淋巴细胞,即活化NK细胞。用多色实验的补偿管(CD56和CD69单阳性管)调整荧光间补偿,顺序上样,获取数据文件,每个样本收集10000个细胞。 (6)分析卵泡液中CD56~+NK细胞及活化的CD56~+NK细胞与IVF结局(妊娠、未妊娠)的关系。 2、统计学方法 对实验结果用SPSS软件进行数据分析。 实验结果 妊娠患者的卵泡液中平均CD56~+NK细胞及活化的CD56~+NK细胞所占的比例分别为18.80±2.75%和1.60±0.75%,未妊娠患者的卵泡液中平均CD56~+NK细胞及活化的CD56~+NK细胞所占的比例分别为37.39±5.82%和4.73±1.88%,未妊娠组均显著高于妊娠组(P＜0.05),有统计学意义。 结论 接受IVF助孕治疗患者的成熟卵泡液中CD56~+NK细胞及活化的CD56~+NK细胞的比例与妊娠结局有关,较低者易获临床妊娠。