大鼠脑挫伤后基质金属蛋白酶3表达变化的研究

【摘要】： 前言 脑挫伤是法医学工作中常见的损伤类型,推断脑挫伤时间对刑事案件的侦查及审判具有重要意义,然而准确推断脑挫伤时间一直是法医学中的难题,至今尚未圆满解决。基质金属蛋白酶3(matrix metaUoproteinase-3,MMP-3)是基质金属蛋白酶家族的重要成员,参与组织形态发生、损伤修复、炎症反应等一系列的生理、病理过程,在脑挫伤修复过程中具有重要的调节作用。本实验通过建立大鼠脑挫伤模型,研究基质金属蛋白酶3在脑挫伤修复过程中的表达变化规律,以期为法医学实践中准确推断脑挫伤时间提供一种新的方法。 材料与方法 一、动物模型的制作,分组与对照 雄性SD大鼠50只,体重在200-250g之间,由中国医科大学实验动物部提供。随机分为10组,每组5只,其中8组为实验组,1组为对照组,1组为假手术组。实验组采用吴旭等研制的大鼠脑挫伤模型制作方法,制造大鼠脑挫伤模型。大鼠称重后,乙醚吸入预麻醉,2%戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔注射麻醉。正中切开大鼠顶部头皮,在人字缝前3mm,矢状缝旁3mm处钻直径为5mm的圆形骨窗,保持硬脑膜完好。采用自由落体打击装置,以30g重锤从25cm高处落下,打击暴露的脑组织。术后动物分笼饲养,保持垫料清洁及空气通畅。于伤后6h、12h、24h、3d、5d、7d、10d、14d将大鼠麻醉后脱颈椎处死,手术取出脑组织,沿冠状方向将挫伤区平均分为两部分,一份用于免疫组化染色,另一份用于Western blot检测。假手术组仅行颅骨钻孔。对照组及假手术组,以同样方法取相同部位的脑组织作为对照。 二、免疫组织化学染色 脑组织经4%多聚甲醛固定后,水洗,梯度酒精脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,制作5μm厚度切片。采用链霉素-生物素法(SP法)进行免疫组化染色,并用苏木素复染细胞核,具体步骤同试剂盒说明书。MMP-3抗体1:400稀释,4℃孵育过夜。染色过程中另以PBS替代一抗,作为阴性对照。同时进行常规H.E.染色。山羊抗大鼠MMP-3多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司,SP免疫组织化学试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。 三、Western blot检测 提取脑组织蛋白并进行蛋白定量,聚丙烯酰胺凝胶电泳,半干法转印,5%脱脂牛奶封闭,一抗(1:1000稀释)、二抗(1:2500稀释)孵育后,ECL显色。实验中以GAPDH为内参。 实验结果 一、免疫组织化学染色结果 对照组及假手术组脑组织未见MMP-3阳性染色。实验组中,伤后6h组脑组织开始出现阳性染色,胞浆着色,程度较弱,阳性细胞主要为神经元,12h组染色程度增强。伤后24h组表达MMP-3的神经元显著增多,并可见少量胶质细胞出现MMP-3阳性。3d组MMP-3阳性染色进一步增强,伤后5d组阳性细胞数及染色强度都达到高峰,呈深棕黄色,弥漫分布于神经元及胶质细胞的胞浆和胞核中。伤后7d组MMP-3阳性染色开始减弱,10d组阳性细胞减少,至伤后14d仍有少量MMP-3表达。使用Motic Images Advanced 3.2软件对各组MMP-3免疫组化染色阳性反应物进行检测,统计分析结果显示,阳性反应物面积百分比及阳性反应物平均光密度值差异均具有统计学意义(P＜0.05)。 二、Westerna blot结果 对照组及假手术组脑组织未见MMP-3表达,挫伤后6h开始出现MMP-3表达,随后表达量逐渐上升,5d达到高峰,以后逐渐下降,14d时仍有表达。应用Fluorchem V 2.0 Stand Alone软件获取感光条带的平均灰度值,经统计分析,差异有统计学意义(P＜0.05)。 结论 本实验在建立大鼠脑挫伤模型的基础上,应用免疫组织化学染色、Western blot方法检测大鼠脑挫伤后MMP-3表达情况,结果表明: 1、正常大鼠脑组织无MMP-3表达: 2、大鼠脑挫伤后6h即可见MMP-3表达; 3、大鼠脑挫伤后MMP-3表达情况呈规律性变化,提示MMP-3可作为脑挫伤时间推断的指标之一。