Smad2反义寡核苷酸对高糖培养人肾小球系膜细胞分泌纤连蛋白，层粘连蛋白的影响

【摘要】： 前言 糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病(diabetes mellitus,DM)的常见而严重的慢性并发症之一,是导致终末期肾功能衰竭的首要致病原因。DN的发病机制尚不清楚,大量研究表明多种因素参与了其发生发展,其中转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)/Smad信号通路在其发生发展中起重要作用。TGF-β信号系统是细胞生长和分化的重要调节剂,Smads蛋白是TGF-β信号系统细胞内的重要转导因子,在TGF-β的刺激下Smads蛋白在核内积聚调节靶基因的转录。Smad 2是Smads蛋白家族成员之一,它是TGF-β1在细胞内特有的作用底物,因此Smad 2与TGF-β受体短暂的结合和磷酸化是Smad复合体在细胞核内蓄积所必须,是信号转导的始动因子。 DN主要表现为肾小球硬化和肾小管间质纤维化,DM的高糖状态下TGF-β1系统激活,Smad2蛋白可通过转导TGF-β信号促进细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)的合成与沉积,使系膜基质增多,肾小球毛细血管基底膜增厚,致糖尿病肾病的发生发展。 纤连蛋白(fibronection,FN)和层粘连蛋白(lamimin,LN)是细胞外基质的重要组成成分,本实验通过给体外常规培养的人肾小球系膜细胞转染Smad2反义寡核苷酸(oligodeoxynudeotides,ODN),直接抑制Smad2基因的激活,观察其对FN,LN分泌的影响,探讨Smad2在糖尿病肾病中的作用,寻找延缓肾小球硬化的新途径。 研究对象与方法 1、材料 细胞:人肾小球系膜细胞(美国ScienCell Research Laboratory,编号4200) 试剂:细胞完全培养基(美国ScienCell Research Laboratory,编号4201),Lipofectamine 2000(美国Invitrogen Life Technologies),Smad2正义、反义寡核苷酸(上海生工生物工程技术服务有限公司),FN,LN ELISA试剂盒(上海森雄公司)。 仪器:冰箱,离心机,恒温箱,显微镜,荧光显微镜,细胞培养实验台等。 2、实验方法 常规培养人肾小球系膜细胞,传代至5～8代用于实验,给予转染不同剂量及比率的寡核苷酸和脂质体,观察转染效率。此后实验选用最佳转染效率组转染。 取常规培养传代至5～8代人肾小球系膜细胞,分为六组:①高糖组:葡萄糖30mmol/L,②转染Smad2反义ODN组:葡萄糖30mmol/L,Smad2反义ODN0.8μg,Lipofectamine 2000 2.0μl,③转染Smad2正义ODN组:葡萄糖30mmol/L,Smad2正义ODN0.8μg,Lipofectamine 2000 2.0μl,④脂质体组:葡萄糖30mmol/L,Lipofectamine 2000 2.0μl,⑤正常糖组:葡萄糖5.0mmol/L,⑥甘露醇组:甘露醇25mmol/L,葡萄糖5.0mmol/L。分别取0h、18h、24h、48h、72h培养上清液,ELISA法检测FN,LN含量。 结果 通过实验观察发现ODN的转染效率因ODN和Lipofectamine 2000的剂量和比率不同而不同,其中ODN:Lipofectamine 2000=0.8μg∶2.0μl=1∶2.5转染率最高。人肾小球系膜细胞经高糖培养后LN和FN分泌较正常糖组明显增加,转染反义ODN组LN和FN分泌明显减少,转染正义ODN组LN和FN分泌无明显减少,甘露醇组与正常糖组相比LN和FN分泌相似,脂质体组与高糖组LN和FN分泌分泌相似。 结论 高糖刺激人肾小球系膜细胞能增加其细胞外基质FN和LN的合成和分泌,而Smad2反义ODN能抑制FN和LN的分泌,Smad2正义ODN不能抑制FN和LN的分泌,脂质体在其中起到瞬时转染ODN的作用,而对FN和LN的分泌无抑制作用,甘露醇组与高糖组的渗透压相同,而不引起FN和LN分泌增加,说明刺激人肾小球系膜细胞分泌LN和FN的因素是高糖,而非高渗透压。