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体外诱导人胎盘间充质干细胞分化为软骨细胞的实验研究

张钰  
【摘要】: 目的 间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)是属于中胚层的一类多能干细胞,主要存在于结缔组织和器官间质中,以骨髓组织中含量最为丰富。近年来,随着人们对间充质干细胞生物学特性及功能的深入研究,已成功地从人骨髓、外周血、肌肉、脂肪、脐血、羊水及胎儿组织中分离并鉴定出MSCs。胎盘作为胚胎发育中维系母体和胎儿氧气及营养物质交换的重要暂时性器官,由起源于细胞滋养层和胚外中胚层的胎儿丛密绒毛膜和母体子宫基蜕膜共同组成,无论从解剖结构还是在发育行为上,都包含了较为幼稚的胚胎及趋于成熟的成体干细胞成分;胎盘在胎儿娩出后即完成使命,成为“废弃”物,对其研究不会涉及伦理道德问题,因此目前已成为寻找人类间充质干细胞新来源及提高临床应用效果的研究热点。本文就人胎盘来源的间充质干细胞(Placenta-derived Mesenchymal Stem Cells,PMSCs)体外分离和培养的方法及PMSCs在单层培养中向软骨细胞定向分化的条件作以论述。 方法 1、人胎盘间充质干细胞的提取 取足月剖宫产胎儿的胎盘,剥离子体蜕膜,剪取蜕膜下组织,PBS冲洗两次,室温静置10min,将组织块剪碎约1mm~3,均匀置于培养器底部,应用10%DMEM培养基培养于37℃5%CO_2培养箱,每3d换液一次,待细胞沿培养器底部生长面积达80%~90%时,按常规方法传代。 2、胎盘细胞表型测定 取第3代细胞,以0.25%胰蛋白酶消化3min后,调整细胞数为1×10~6/L,加入5μL小鼠血清封闭15min后,加入鼠抗人PE标记的单克隆抗体,冰上避光反应20min,PBS洗2次后,4℃1000r/min离心5min,弃上清后加入200μL冷PBS吹打混匀后,流式细胞仪检测。 3、诱导分化 将第3代胎盘来源的间充质干细胞胰酶消化后制成细胞悬液,离心弃上清后PBS洗3遍,分别以2×10~4/cm~2密度接种于预先以0.1%明胶涂抹的六孔细胞培养液中,待细胞贴壁后改换软骨诱导剂,置于37℃5%CO_2培养箱中培养,每3d换液一次。 4、甲苯胺蓝染色 取培养21d的两组细胞,PBS换2遍后,4%多聚甲醛固定15~30min,PBS洗3遍后,1%甲苯胺蓝染色2~4h,95%酒精洗3遍后光镜下观察。 5、免疫细胞化学检测Ⅱ型胶原表达 具体步骤按SABC染色试剂盒说明书操作,并弃孔板中培养液,PBS(0.02mol/LpH7.2~7.6)液洗3遍,4%多聚甲醛固定30min,0.3%H_2O_2灭活内源性酶,BSA封闭后分别加入1:200稀释的兔抗人-抗Ⅱ型胶原,4℃孵育过夜,用山羊抗兔-小鼠IgG孵育1h,DAB显色剂显色,苏木精复染后光镜下观察。 结果 组织块培养11d左右,可见少量细胞爬出,呈圆形或多角形,随细胞数目增多,细胞呈旋涡状生长,胞体变细长,形态类似成纤维细胞,培养3w左右,细胞可达80%融合,细胞传代贴壁后,重新长成梭形细胞,该细胞传至20代仍可稳定生长。流式细胞仪检测显示,来源于人胎盘组织的第3代细胞表达CD13、CD44、CD73、CD90、CD166、HLA-AB,不表达CD34、CD45、HLA-DR,与骨髓来源的间充质干细胞具有相似的细胞表面标志。细胞在诱导开始时,细胞增殖速度较慢,诱导一周时即已停止增殖,细胞形态发生改变,细胞体积变大,部分细胞由原来的梭形逐渐变成多边形,细胞形态不一,整个诱导分化过程细胞未传代。细胞在诱导21d时甲苯胺蓝染色可见细胞间基质呈蓝紫色。Ⅱ型胶原免疫细胞化学检测均发现细胞胞浆内有棕黄色颗粒的阳性结果。 结论 1、人胎盘来源的间充质干细胞可成功在体外培养并大量扩增,生物学性状稳定,是组织工程优良的种子细胞来源之一。 2、本实验在单层培养条件下,成功将人胎盘间充质干细胞诱导分化成软骨细胞。经诱导培养后形成的软骨细胞具有软骨细胞的形态特征,并能分泌软骨细胞特异性Ⅱ型胶原。


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