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免疫抑制剂和紫外线对角质形成细胞分泌趋化因子的影响

肖汀  
【摘要】: 前言 趋化因子(chemokine)是一类小分子量(8-14 kDa)的分泌性蛋白质,通过一组具有7个跨膜结构区的G蛋白偶联受体引导各类白细胞定向移动。可分为4个亚族:CXC(α),CC(β),C(γ)和CX3C(δ)。根据其趋化功能,趋化因子可分为1型趋化因子和2型趋化因子。目前认为,1型趋化因子有三种:干扰素-γ诱生的单核因子(monokine induced by gamma-interferon,CXCL9/Mig)、干扰素γ诱导蛋白10(IFN-γ-inducible protein-10,CXCL10/IP-10)和干扰素诱导的T细胞α趋化因子(IFN-inducible T cellαchemoattractant,CXCL11/I-TAC),均属于CXC(α)亚族,它们共同的受体是CXCR3,可以选择性趋化表达CXCR3的Th1/Tc1细胞;2型趋化因子有两种:胸腺和激活调节趋化因子(thymus and activation-regulatedchemokine,CCL17/TARC)和巨噬细胞衍生趋化因子(macrophage-derivedchemokine,CCL22/MDC),属CC(β)亚族,它们共同的受体是CCR4,可选择性趋化表达CCR4的Th2/Tc2细胞。 研究表明,Th1/Tc1占主导的皮肤病如银屑病、扁平苔藓等皮损中的角质形成细胞高表达CXCL11/I-TAC和CXCL9/Mig;而真皮中大部分T细胞表达CXCR3。提示CXCL11/I-TAC、CXCL9/Mig及其受体CXCR3在该类慢性炎症性皮肤病的发病机制中起重要作用。近年来,越来越多的证据表明,Th2/Tc2占主导的皮肤病如特应性皮炎(atopic dermatitis,AD)皮损或外周血中高表达CCL22/MDC。1型细胞因子干扰素γ(interferon-γ,IFN-γ)和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)在Th1/Tc1类型皮肤病的皮损中高表达;在Th2/Tc2占主导的AD慢性期皮损中,IFN-γ和TNF-α也高表达并起重要作用。研究显示,IFN-γ和TNF-α是最强的诱导角质形成细胞合成CXCL11/I-TAC、CXCL9/Mig和CCL22/MDC的细胞因子。文献表明,免疫抑制剂和紫外线治疗Th1/Tc1或Th2/Tc2占主导的炎症性皮肤病有效。然而,这些因素对角质形成细胞分泌CXCL11/I-TAC、CXCL9/Mig和CCL22/MDC的影响尚不清楚。 目的 观察三种免疫抑制剂地塞米松、甲氨蝶呤、雷公藤内酯醇,长波紫外线UVA、窄谱中波紫外线NB-UVB对人角质形成细胞系HaCaT分泌1型趋化因子CXCL11/I-TAC、CXCL9/Mig和2型趋化因子CCL22/MDC的影响。探讨免疫抑制剂和紫外线治疗Th1/Tc1或Th2/Tc2占主导的慢性炎症性皮肤病的机制。 材料与方法 一、材料 (一)主要试剂 地塞米松、甲氨蝶呤(美国Sigma公司),雷公藤内酯醇(中国医学科学院皮肤病研究所药物研究室),人重组IFN-γ、TNF-α(英国PeproTech公司)、人CXCL11/I-TAC、CXCL9/Mig和CCL22/MDC ELISA试剂盒(美国RD公司)。 (二)设备 紫外线照射采用SS-03紫外线光疗仪(上海希格玛高技术有限公司)。UVA波长峰值365 nm,NB-UVB波长311±1 nm。辐射度(irradiance)用MS-211-1 UVMonitor(日本Eko公司)标定。 二、方法 (一)细胞培养 在37℃、5%CO_2条件下,用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液(丹麦Hyclone公司)将HaCaT细胞(何春涤教授由德国自由大学本杰明·富兰克林医学中心带回)贴壁培养于150 cm~2的培养瓶中。待细胞生长至80%~90%融合时,用0.05%胰蛋白酶消化后传至六孔板(1×10~6个细胞/孔)。12h后,待细胞生长至80%~90%融合时,更换成不含胎牛血清的RPMI 1640培养液。 (二)实验分组 1、免疫抑制剂组 地塞米松组、甲氨蝶呤组和雷公藤内酯醇组分别用不同浓度的地塞米松(0.01,0.1,1,10 ng/ml)、甲氨蝶呤(0.1,1,10 ng/ml)和雷公藤内酯醇(0.001,0.01,0.1,1ng/ml)刺激HaCaT细胞,同时加入10 ng/ml的IFN-γ和/或10 ng/ml的TNF-α,刺激时间为24 h。 2、紫外线组 UVA组和NB-UVB组分别用不同剂量的UVA(1,2,4,6,8 J/cm~2)和NB-UVB(0.01,0.05,0.1 J/cm~2)或(0.02,0.04,0.06,0.08,0.1 J/cm~2)照射HaCaT细胞,照射后立即加入10 ng/ml的IFN-γ和/或10 ng/ml的TNF-α,然后培养24 h。 3、对照组 不予紫外线照射、免疫抑制剂刺激的HaCaT细胞作为阴性对照组。用10 ng/ml的IFN-γ和/或10 ng/ml的TNF-α联合刺激的HaCaT细胞作为阳性对照组。 各组相同的刺激条件用4个复孔,24 h后回收上清液,-20℃保存。 (三)RT-PCR 用TRIzol(Invitrogen公司)提取总RNA。逆转录及扩增采用RNA PCR Kit Ver2.1(Takara公司),操作步骤按说明书。CXCL11/I-TAC引物序列:上游:5'-GCTATA GCC TTG GCT GTG ATA TTG TG-3';下游:5'-CTG CCA CTT TCA CTG CTTTTA CC-3'。人β-肌动蛋白(β-actin)引物序列:上游:5'-ACA CTG TGC CCA TCTACG AGG GG-3';下游:5'-ATG ATG GAG TTG AAG GTA GTT TCG TGG AT-3'。利用上述引物扩增218 bp的CXCL11/I-TAC和340 bp的人β-actin DNA片段。 (四)ELISA 严格按商品化的人CXCL11/I-TAC、CXCL9/Mig和CCL22/MDC ELISA试剂盒(美国RD公司)操作说明进行。用酶标仪(美国Bio-Rad公司)读取450 nm处的OD值,根据标准曲线用间接法求出各孔趋化因子的含量。 (五)细胞生存率的测定 培养24 h后,回收各组各孔上清中的HaCaT细胞,用胰酶处理使底壁的细胞脱壁。离心,用PBS混悬,台盼蓝染色判定死细胞,计算存活细胞的百分比。 (六)统计学分析 各组趋化因子浓度均值比较采用Student t检验。P值<0.05认为有统计学意义。 结果 一、RT-PCR 培养24 h后,未加任何刺激的HaCaT细胞不表达CXCL11/I-TAC mRNA。用10 ng/ml的IFN-γ或TNF-α刺激的HaCaT细胞均表达CXCL11/I-TAC mRNA,IFN-γ的诱导表达作用更强。甲氨蝶呤(10 ng/ml)、地塞米松(10 ng/ml)、雷公藤内酯醇(1.0 ng/ml)均不能诱导HaCaT细胞表达CXCL11/I-TAC mRNA。 二、ELISA 地塞米松、甲氨蝶呤和雷公藤内酯醇这三种免疫抑制剂对HaCaT细胞分泌的CXCL11/I-TAC、CXCL9/Mig和CCL22/MDC表现出相似的抑制,差异有统计学意义。UVA在一定的剂量范围内均可抑制IFN-γ和/或TNF-α诱导的HaCaT细胞分泌的CXCL11/I-TAC、CXCL9/Mig和CCL22/MDC水平,差异有统计学意义;NB-UVB在较低剂量和较高剂量下对趋化因子的分泌表现为双向调节。 三、各组的细胞生存率 阴性对照组、阳性对照组、UVA组、NB-UVB组、地塞米松组、甲氨蝶呤组和雷公藤内酯醇组的HaCaT细胞平均生存率均高于90%,差异均无统计学意义。 结论 本研究首次报告了三种免疫抑制剂地塞米松、甲氨蝶呤和雷公藤内酯醇和紫外线UVA、NB-UVB对人角质形成细胞HaCaT分泌的1型趋化因子CXCL11/I-TAC、CXCL9/Mig和2型趋化因子CCL22/MDC的抑制作用。免疫抑制剂和紫外线对Th1/Tc1或Th2/Tc2占主导的炎症性皮肤病的治疗机制,可能与其抑制角质形成细胞分泌的1型或2型趋化因子有关,从而减少Th1/Tc1或Th2/Tc2细胞在皮肤中的浸润,减轻炎症反应。


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