收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

东北林蛙皮抗菌肽及其生物学特性

金莉莉  
【摘要】: 前言 抗菌肽(antimicrobial peptides)是广泛存在于生物界中的一类生物活性肽,由10-50个氨基酸构成。抗菌肽具有相对分子量低、水溶性好、低抗原性和热稳定性强等特点,多数抗菌肽具有抗细菌或真菌的作用,有些还具有抗原虫、病毒或肿瘤细胞的功能,并对动物体内的正常细胞影响较小。此外,由于抗菌肽是通过干扰原核细胞膜结构导致质膜通透性增大,从而引起抑菌或杀菌作用,病原体不易对其产生抗药性,这使其成为新一代抑菌药物的首选研究对象。新的抗菌肽的鉴定及生物学特性研究可为新型抗生素的研发及设计提供分子模板。 两栖类动物是从水生鱼类演化到真正陆地生的爬行类动物之间的过渡类群,它们皮肤裸露、湿润,无疑给外界微生物的侵入提供了便利条件,因此在长期的进化历程中,它们的皮肤中演化形成了一套有效的抵御微生物侵袭的防御系统——抗菌肽。为开拓和适应广阔的栖息地及多样的生态条件,相对于其他生物组织而言,两栖类动物皮肤含有数量和种类更多的抗菌肽,是天然抗菌肽巨大的资源库。蛙科(Ranidae)动物是分布最广泛的两栖动物,几乎遍及各大洲,占据着不同的生态地位,它们皮肤抗菌肽在种类和数量等方面,都是极其惊人的。 东北林蛙(Rana dybowskii)为主要分布在我国东北长白山脉的重要经济动物,我们的前期工作研究表明,东北林蛙皮分泌物由多种组分组成,其皮肤分泌物抗菌肽粗提物具有广谱的抗菌活性,但其具体成分、结构特点、生物学特性尚不清楚。为系统认识和了解东北林蛙皮抗菌肽特点,本文根据两栖类抗菌肽的保守氨基酸序列设计简并引物,以东北林蛙皮cDNA文库为模板,采用PCR方法克隆并测定了抗菌肽cDNA基因。同时结合质谱技术对东北林蛙皮分泌物进行了分析,鉴定东北林蛙皮抗菌肽分子。对部分东北林蛙抗菌肽进行人工合成或真核细胞表达,并对其结构、生物学功能等进行分析。 方法 一、东北林蛙皮抗菌肽鉴定及分子多样性 1.东北林蛙皮抗菌肽cDNA克隆及序列分析 在GenBank中选取已报道的蛙类抗菌肽mRNA序列,经CLUSTALW多序列对比(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/),根据保守序列设计林蛙抗菌肽基因cDNA的5'端简并引物:5'-ATG TTC ACC (A/T) TG AAG AAA-3'。以3'端多聚A为模板,设计反转录引物:5'-CTG ATC TAG AGG TAC CGG ATC CTT TTT TTTTTT TTT TTT T-3'。调取抗菌肽基因,连接pMD19-T载体,克隆测序。测得的序列递交NCBI网站进行同源性分析和氨基酸序列分析。 2.东北林蛙皮抗菌肽质谱测序 以温和电击方法,刺激东北林蛙背部皮肤,获得皮肤分泌物,冷冻干燥,进行电喷雾电离/质谱/质谱(ESI-MS/MS)分析及序列测定。 3.东北林蛙皮抗菌肽基本性质的生物信息学分析 利用ExpasyProtParam在线分析软件,计算抗菌肽理论分子量、等电点。并依据Kyte and Doolittle方法计算平均疏水值(grand average hydropathy,GRAVY)。 二、东北林蛙皮抗菌肽结构与生物学特性 1.抗菌肽人工合成 以wang和Rink amidate-MBHA树脂为载体,采用对Fmoc或Boc作为α氨基的保护基,人工固相合成法合成东北林蛙抗菌肽。SephadexTM G-15柱层析纯化合成肽,RP-HPLC和电喷射离子质谱(ESI-MS)检测。 2.东北林蛙抗菌肽的结构分析 抗菌肽二级结构采用ExPASy系统中提供的神经网络预测方法(HNN)进行预测。预测二级结构为α-螺旋的抗菌肽序列利用Antheprot release 5.0进行螺旋轮(Helical wheel)预测,非α-螺旋抗菌肽利用ProBuider(http://nova.colombo58.unimi.it/probuilder.htm)把序列转换为~*.pdb文件,进行蛋白的1D到3D的转换,使用VMD显示,分析氨基酸分布。 以50%三氟乙醇/PBS溶液拟膜,利用圆二色技术测定合成肽在PBS和50%三氟乙醇/PBS溶液中CD光谱,分析二级结构。 3.抑菌活性和最小抑菌浓度 利用琼脂平板法检测抗菌肽抑菌活性,采用微量稀释法测定最小抑菌浓度。 4.溶血活性分析 微量溶血试验、血平板法测定抗菌肽溶血活性。 5.稳定性 分别将抗菌肽用以下方法处理:0.25%胰酶37℃消化1小时;反复冻融3次;煮沸5分钟;煮沸30分钟。处理后的抗菌肽利用菌落计数法检测活性。 三、东北林蛙皮新型抗菌肽dybowskin-2CDYa表达、活性及结构 1.重叠延伸PCR(gene splicing by overlap extension PCR,SOE PCR)扩增dybowskin-2CDYa基因 根据巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)偏爱密码子、dybowskin-2CDYa成熟肽cDNA序列,设计合成引物Zα1 5'CCGCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTTCCGCTGTTGGTAGACACGGTAGAAGATTCGG3'、Zα25'CTAGTCTA GAAATCATCAGTGCTTTCTGTGCTTTCTCAAACCGAATCTTCTGGAGTGTC 3'、Zα11 5'CCGCTCGAGAAAAGAGAG3'和Zα9K 5'CGGAATTCCTAGTCTAGAAATCATCAGT3',添加XhoⅠ、XbaⅠ酶切位点。利用SOE PCR获取dybowskin-2CDYa全长基因。 2.重组质粒构建 电泳回收dybowskin-2CDYa片段,限制性内切酶XhoⅠ和XbaⅠ双酶切pPICZαA和dybowskin-2CDYa片段,T4 DNA连接酶连接,转化感受态细胞JM109,筛选得到的阳性重组质粒进行测序,并对测序结果进行分析。 3.dybowskin-2CDYa在毕赤酵母中表达 SacⅠ对重组质粒进行单酶切线性化,转化毕赤酵母GS115,阳性转化子摇瓶诱导表达。发酵上清液的抑菌活性检测、RT-PCR mRNA水平检测,液相色谱和质谱检测目的基因转录和表达。 4.蛋白含量测定 用BCA法测定发酵液上清的总蛋白浓度,计算重组抗菌肽含量。 5.表达产物纯化及活性分析 旋转蒸发浓缩上清液,浓缩液经凝胶过滤层析、RP-HPLC纯化,获得重组蛋白。利用琼脂平板法检测抗菌肽抑菌活性。血平板法测定抗菌肽溶血活性。 6.dybowskin-CDYa结构分析 抗菌肽二级结构采用ExPASy系统中提供的神经网络预测方法HNN进行预测。利用Antheprot release 5.0进行螺旋轮预测。 以50%三氟乙醇/PBS溶液拟膜,利用圆二色技术测定dybowskin-CDYa在PBS和50%三氟乙醇/PBS溶液中CD光谱,分析二级结构。 结果 一、东北林蛙皮抗菌肽序列分析 挑选阳性克隆子进行测序,使用expasy.org/tools(http://www.expasy.org/)提供的在线分析软件预测氨基酸序列。获得42个基因共编码14种东北林蛙皮抗菌肽。东北林蛙抗菌肽前体由60-67个氨基酸残基构成,包括信号肽、前导肽和成熟肽三部分。信号肽由起始密码子编码的蛋氨酸残基开始,由一组疏水氨基酸残基构成,切割位点位于Cys-Glu之间,长度为22个氨基酸残基,在信号肽和成熟肽之间存在一段前导肽序列(prodomain),东北林蛙皮抗菌肽的成熟肽始于前导肽激素原转化酶切割位点Lys-Arg序列之后。生化性质分析显示,东北林蛙抗菌肽等电点从3.80至12.60,阳离子电荷数从0至10。质谱分析结果表明东北林蛙皮抗菌肽分子量分布范围为1300-3000 Da,质谱测序结果与cDNA序列分析结果一致。 二、东北林蛙皮抗菌肽成熟肽的相似性分析结果 相似性分析结果显示,14种东北林蛙抗菌肽分别归属于temporin家族(temporin-CDYa、temporin-CDYb、temporin-CDYc、temporin-CDYd),brevinin-1家族(brevinin-1CDYa、brevinin-1CDYb、brevinin-1CDYc、brevinin-1CDYd),japonicin-1家族(japonicin-1CDYa),brevinin-2家族(brevinin-2CDYa、brevinin-2CDYb),而dybowskin-1CDYa,dybowskin-2CDYa和dybowskin-2CDYb三肽的氨基酸组成和序列和已报道的抗菌肽具有很小的相似性,经EBIUniProtKB/SWISS-PROT和APD(http://aps.unmc.edu/AP/main.php)查询,未见相似蛋白及肽,属于2类新型抗菌肽。 三、东北林蛙抗菌肽成熟肽的二级结构 神经网络预测方法的HNN预测结果显示,除dybowskin-1CDYa的二级结构为随机卷曲结构外,其它东北林蛙抗菌肽具有形成α-螺旋结构的潜能。圆二色谱远紫外区扫描结果显示,brevinin-1CDYa、temporin-CDYa、temporin-CDYe和japonicin-1CDYa在磷酸盐缓冲液中于192 nm的波长附近有一个正吸收峰,在约208 nm和222 nm处有负吸收峰,在50%三氟乙醇192 nm波长附近的正吸收峰有所加强,而人工合成的东北林蛙新型抗菌肽dybowskin-1CDYa在PBS缓冲液和三氟乙醇拟膜环境中,均无二级结构特征性吸收峰。 四、东北林蛙抗菌肽活性 抑菌活性分析显示东北林蛙抗菌肽具有不同程度的抑菌活性,其中dybowskin-1CDYa具有较强的抑菌活性,对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性菌大肠杆菌的最小抑菌浓度分别为6μg/mL和3μg/mL,同时dybowskin-1CDYa具有低溶血活性(HC_(50)>450μg/mL)。东北林蛙抗菌肽具有较好热稳定性,在煮沸和反复冻融条件下仍保留较好的抗菌活性,但其对胰酶敏感。 五、dybowskin-2CDYa表达、活性、及结构 利用毕赤酵母可以对dybowskin-2CDYa基因进行表达,表达产物量约为0.83mg/mL。活性分析结果显示,dybowskin-2CDYa对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性菌大肠杆菌均有抑制活性,500μM浓度下,未见溶血活性。结构分析显示,dybowskin-2CDYa在PBS亲水环境中是以α螺旋形式存在,而在疏水环境中,无二级结构特征性吸收峰。 结论 1.一只东北林蛙个体可以同时编码表达至少14种抗菌肽,与其它蛙类抗菌肽相同,它们的信号肽和前导肽十分保,成熟肽高度变异。除已报道的抗菌肽家族外,还存在结构新、抗菌强及低溶血活性的新型抗菌肽。 2.东北林蛙皮抗菌肽由13-33个氨基酸残基组成,多为碱性多肽,等电点大于8,带正电荷。除dybowskin-1CDYa外,东北林蛙抗菌肽以α-螺旋结构为主。 3.人工合成东北林蛙皮抗菌肽对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性菌大肠杆菌有不同程度抗菌活性,其中dybowskin-1CDYa抑菌活性较强,最小抑菌浓度分别为6μg/ml和3μg/ml,同时dybowskin-1CDYa具有低溶血活性,半数溶血值大于450μg/ml。 4.东北林蛙皮抗菌肽具有较好的稳定性,在煮沸和反复冻融条件下仍保留抗菌活性,但其对胰酶敏感。 5.利用巴斯德毕赤酵母GS115表达体系能够正确表达得到东北林蛙皮抗菌肽dybowskin-2CDYa。目的多肽的表达量约为0.83 mg/mL。 6.表达得到的dybowskin-2CDYa对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌具有抗菌活性和低溶血活性。dybowskin-2CDYa亲水环境以α-螺旋结构存在,在拟膜环境中无二级结构特征性吸收峰。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 张召兄;潘晓亮;任耀军;;抗菌肽概述及抗菌分子机理的研究进展[J];草食家畜;2006年04期
2 林承德;彭鸿娟;王衍海;;抗菌肽的应用及存在的问题[J];热带医学杂志;2007年01期
3 黄莹;张守纯;赵越;张哲;张宇;赵旭;;抗菌肽基因工程研究进展及其在畜牧生产体系中的应用[J];安徽农业科学;2007年30期
4 张鑫;苗向阳;尹逊河;马艳芳;曲朝杰;张秋婷;;抗菌肽在转基因动植物中的研究进展[J];生物技术通报;2009年02期
5 冯兴军;王建华;单安山;;抗菌肽基因工程研究及其表达策略[J];中国生物工程杂志;2006年03期
6 李敏惠;杨平;何正波;;昆虫抗菌肽及其基因工程研究进展[J];应用与环境生物学报;2006年03期
7 王德成;佘敏;佘锐萍;李文贵;王英华;孙泉;;抗菌肽的构效关系及其基因表达调控的研究进展[J];中国兽医科学;2008年03期
8 崔奕;王平;黄赤夫;;抗菌肽的基因工程研究及应用[J];中南林业科技大学学报;2011年07期
9 杨学明;江林源;蒋和生;;水生动物抗菌肽及其基因工程研究[J];生物技术通讯;2006年01期
10 韩俊友;乔红伟;赵瑞利;胡博;谢芳;王金玲;郑伟;雷连成;韩文瑜;;牛蛙(Rana catesbeiana)蛙皮抗菌肽基因的克隆、测序及其表达[J];中国兽医学报;2007年03期
11 陈勇;苏永全;吴常文;王军;毛勇;徐斌;;大黄鱼Piscidin-like抗菌肽基因部分cDNA的克隆与序列分析[J];厦门大学学报(自然科学版);2008年04期
12 张煜;刘玮;丁汉凤;毕玉平;;抗菌肽的研究进展及在农业中的应用[J];安徽农业科学;2006年03期
13 彭洪海;罗玉萍;李思光;;抗菌肽及抗菌肽转基因植物研究进展[J];生物技术通报;2007年01期
14 卢其能;罗晓明;江辉;邹一平;;抗菌肽的研究进展[J];江西科学;2007年04期
15 魏艳彬;王洪法;;抗菌肽的研究进展[J];中国现代医生;2009年15期
16 赵瑞利;韩俊友;韩文瑜;雷连成;孙长江;冯新;江丽娜;乔红伟;蔡林君;;牛蛙两个新Temporins基因的克隆及其抗菌机制的研究(英文)[J];生物化学与生物物理进展;2009年08期
17 曲朝杰;苗向阳;朱瑞良;张鑫;;抗菌肽的研究进展[J];黑龙江畜牧兽医;2009年07期
18 李建民,马志飞,曹勤洪,周开亚,张双全,戴祝英;中国家蚕抗菌肽CBM1、CBM2的克隆和表达研究[J];生物技术通讯;2005年04期
19 许晓玲;王敏奇;;抗菌肽生物活性的影响因素、作用机制及其基因表达调控[J];中国饲料;2008年07期
20 唐勇;;抗菌肽基因表达系统研究进展[J];饲料工业;2009年07期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 汪以真;韩菲菲;;猪源抗菌肽抗菌、免疫、表达特性及其营养调控的研究进展[A];饲料营养研究进展(2010)[C];2010年
2 徐家萍;王成林;杨莹;尤征英;;多功能抗菌肽及其分子改造的研究进展[A];华东·华中地区第十二次蚕种学术研讨会论文集[C];2010年
3 杨翠军;肖向红;张晶钰;孙雪玲;柴龙会;;黑龙江省东北林蛙低温耐受机制的初步研究[A];第二届全国野生动物生态与资源保护学术讨论会论文摘要集[C];2005年
4 尚德静;白冰;李晓帆;付欣;郑俊杰;;中国林蛙(Rana chensinensis)皮肤抗菌肽基因和功能多样性研究[A];“基因、进化与生理功能多样性”海内外学术研讨会暨中国生理学会第七届比较生理学学术会议论文摘要[C];2009年
5 孙振钧;;蚯蚓抗菌肽研究进展[A];畜牧业环境、生态、安全生产与管理——2010年家畜环境与生态学术研讨会论文集[C];2010年
6 李莲瑞;陈根元;顾海洋;;新疆扁吻鱼抗菌肽基因的克隆和分析[A];格莱姆抗菌肽——抗菌肽开发与应用技术研讨会论文集[C];2009年
7 柯涛;毛晗;董彩华;郭学兰;黄思良;刘胜毅;;油菜抗菌肽基因的生物信息学分析[A];基因开启未来:新时代的遗传学与科技进步——湖北省遗传学会第八次代表大会暨学术讨论会论文摘要汇编[C];2009年
8 杨淑静;肖向红;苗慧敏;柴龙会;周旋;张晶钰;;蛙虹彩病毒刺激下东北林蛙皮肤活性肽的表达变化[A];中国生理学会第23届全国会员代表大会暨生理学学术大会论文摘要文集[C];2010年
9 孙伟;沈以红;王晓莹;向仲怀;张泽;;家蚕抗菌肽基因的进化[A];中国蚕学会第六届青年学术研讨会论文集(3)[C];2009年
10 江丽娜;雷连成;韩文瑜;;牛蛙抗菌肽基因的真核表达及批量生产条件的初探[A];2008年中国微生物学会学术年会论文摘要集[C];2008年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 肖向红;微生物胁迫下东北林蛙皮肤抗菌肽和功能蛋白差异表达的研究[D];东北林业大学;2012年
2 孙龙;两种鞘翅目昆虫抗菌肽的分离纯化与活性研究[D];中国林业科学研究院;2012年
3 丁云超;鱼类卵黄高磷蛋白衍生抗菌肽的免疫调节功能的研究[D];中国海洋大学;2012年
4 王芳;高蛋白海洋解脂耶罗维亚酵母遗传改良以及表达重组抗菌肽的研究[D];中国海洋大学;2011年
5 黄金丰;α-螺旋型膜活性多肽对不同细胞膜的构效关系及作用机理研究[D];吉林大学;2011年
6 温武军;鲤抗菌肽基因的克隆及其功能研究[D];山东师范大学;2011年
7 冯新;重组鲎素的规模化制备及其体内外生物学效应与作用机制[D];吉林大学;2011年
8 金莉莉;东北林蛙皮抗菌肽及其生物学特性[D];中国医科大学;2009年
9 李丽;抗菌肽Abaecin制备及其对肉鸡生长及免疫影响的研究[D];内蒙古农业大学;2010年
10 吕毅;海蛙(Fejervarya cancrivora)皮肤分泌液中抗菌多肽的分离纯化、分子克隆以及结构与功能的研究[D];南京农业大学;2009年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 苗慧敏;虹彩病毒胁迫下东北林蛙皮肤抗菌肽表达及其生物学活性分析[D];东北林业大学;2012年
2 徐佳佳;特定细菌胁迫下东北林蛙(Rana dybowskii)皮肤抗菌肽分泌的动态变化[D];东北林业大学;2010年
3 郭娜;东北林蛙皮肤抗菌肽dybowskin-1ST毕赤酵母表达体系的构建[D];东北林业大学;2011年
4 李晓平;哈尔滨地区黑斑蛙(Rana nigromaculata)夏季皮肤抗菌肽多样性的研究[D];东北林业大学;2010年
5 宋涛;奶牛血液红细胞抗菌肽的分离与纯化[D];河南科技学院;2010年
6 高飞;抗菌肽快速筛选方法与抗菌活性的研究[D];江南大学;2011年
7 黄平;草鱼肠道抗菌肽分离纯化及部分理化性质的研究[D];中南林业科技大学;2009年
8 梁苏;一种高效克隆抗菌肽编码基因的新方法[D];湖北大学;2011年
9 潘朋朋;光滑爪蟾皮肤抗菌肽的分离纯化及生物活性的鉴定[D];吉林大学;2012年
10 谭娟娟;抗菌肽的构效关系与活性机理的研究[D];吉林大学;2012年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 记者 曹继军 通讯员 赵如江;我科学家首次发现附睾中一种抗菌肽基因[N];光明日报;2001年
2 张学全;我国生命科学研究领域取得重大突破[N];中国医药报;2001年
3 吴存远 记者 朱彤;我首次证实绵羊生殖系统中存在抗菌肽[N];科技日报;2010年
4 ;原来生育可调控[N];新华每日电讯;2001年
5 暨南大学医药生物技术研究开发中心 郑青博士后;抗菌肽 前景广阔的新型抗生素[N];医药经济报;2001年
6 奇云;男性避孕药物何时问世[N];中国医药报;2002年
7 本报记者 薛冬  通讯员 吴保平;生命科学在这里闪光[N];光明日报;2002年
8 本报记者 杜军玲;建立自己的创新体系[N];人民政协报;2002年
9 毛杰;神奇昆虫入菜入药[N];北京科技报;2003年
10 艾夫;我国棉花抗黄萎病研究获重大成果[N];中国纺织报;2003年
中国知网广告投放
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978