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RNA干扰HER-2/neu基因对子宫内膜癌Ishikawa细胞增殖及其对孕激素敏感性的影响

刘淼  
【摘要】: 前言 子宫内膜癌(Endometrial Carcinoma,EMC)是女性生殖道最常见的恶性肿瘤之一,近年来其发病率有增高的趋势,尤其在欧美一些国家已跃居女性生殖道恶性肿瘤的首位。各型内膜癌有不同程度的HER-2表达,说明HER-2在各型子宫内膜癌的发生、发展过程中起一定作用。近年研究发现,子宫内膜癌中HER-2的表达程度与患者的不良预后相关。RNA干扰(RNA interference,RNAi)是近年发展起来的新的基因阻断技术,是指通过21-23nt短双链RNA(dsRNA)诱导的序列特异性的基因沉默,现已成为分子生物学研究中最为活跃的热点之一。与反义RNA相比,RNAi技术的成功率更高,并能使目的基因表达降至一个更低的水平,达到基因敲除效果。作为一种高效、特异性的基因敲除工具,RNAi不仅可用来研究功能基因组,同时也为基因治疗提供了广阔前景。 目的 观察shRNA表达质粒靶向沉默HER-2/neu基因对Ishikawa子宫内膜癌细胞增殖及对孕激素敏感性的影响。 方法 针对HER-2/neu基因序列构建短发夹状siRNA真核表达载体(pSilencer4.1-CMV HER-2/neu),转染子宫内膜癌细胞株Ishikawa,分别于转染24、48、72小时后,采用Western Blot法检测p185蛋白的表达,Annexin V试剂盒检测细胞凋亡,于转染72h流式细胞术检测细胞周期的变化;于转染12h后各组分别加入不同浓度孕激素作用48h,用MTT法检测不同浓度孕激素分别作用于未转染及转染后的细胞增殖率的改变。 结果 测序证实成功构建HER-2/neu的2个短发夹状siRNA真核表达质粒,转染Ishikawa细胞后,转染了特异性HER-2/neu shRNA的细胞p185蛋白水平均明显低于转染无义对照序列的细胞;细胞凋亡分析显示,HER-2/neu基因沉默的细胞凋亡率明显增加(P0.01);与非特异性对照组及空白对照组相比,转染shRNA 72h后处于G_0/G_1期细胞增多,同时S期的细胞比例减少;MTT分析显示RNAi与孕激素联合作用组细胞增殖率明显低于非特异性干涉组及空白对照组(P0.01)。 结论 靶向HER-2/neu基因的短发夹状siRNA可明显降低p185蛋白的表达、增加细胞的凋亡并阻滞细胞周期于G_0/G_1期;HER-2/neu基因沉默与孕激素联合作用的Ishikawa子宫内膜癌细胞增殖明显受抑制并且细胞对孕激素的敏感性显著增高。


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