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干扰素α-2b突变体的分子获得及性能分析

王秀  
【摘要】: 目的 干扰素α(Interferon-α,IFN-α)是一类重要的细胞因子,具有广谱抗病毒、抗细胞分裂和免疫调节作用,临床上广泛应用于多种病毒性疾病和肿瘤的治疗。IFN作为蛋白质类药物,主要存在生物半衰期短和活性不稳定的问题,前者要求给病人频繁注射,后者致使药物在大剂量长期使用时产生较大副作用,因此开发长效和高效的IFN是目前的发展方向。 通过改变分子内蛋白酶水解位点可以影响IFN的性能。本研究在分析IFNα-2b分子结构的基础上,选择处于非受体结合位点、位于空间结构表面且非保守序列的糜蛋白酶和谷氨酸-C内蛋白酶水解位点作为突变点,分别将第58位谷氨酸、第89位酪氨酸和第159位谷氨酸通过定点突变技术采用组氨酸进行置换。经Percent Accepted Mutation Matrix分析认为这三个位点被组氨酸置换后在进化上不会造成太大的差异,且不会产生新的蛋白酶的酶切位点。通过此结构改建,期望获得活性增高、分子更加稳定的新型IFNα-2b突变体。本研究的目的之一是从分子水平改变IFN,构建两条突变体分子:突变体1:IFNα-2bHis~(58);突变体2:IFNα-2bHis~(89)/His~(159)。 通过克隆IFNα-2b两突变体基因,并保留未突变的IFNα-2b基因,以便于从生物学活性及体内稳定性上对三者进行比较,探讨能否通过这一方法达到保证和改善必需的生物活性的同时改善IFN在血液中的稳定性,这是本研究的目的之二。 方法与结果 1、IFNα-2b及其两突变体基因的克隆与构建 本课题利用定点突变PCR的方法,将IFNα-2b分子上第58位Glu突变为His,得到IFNα-2b突变体1:IFNα-2bHis~(58);将IFNα-2b分子上第89位Tyr突变为His,第159位Glu突变为His,得到IFNα-2b突变体2:IFNα-2bHis~(89)/His~(159)。为了进行比较,同时扩增了未突变的IFNα-2b基因。将扩增的这三段基因和原核表达载体pET23b分别用NdeⅠ和EcoRⅠ双酶切,再用T4DNA连接酶将pET23b与三段基因分别连接,所得的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),进行筛选鉴定。 三个重组质粒经NdeⅠ和EcoRⅠ双酶切鉴定表明在500bp处有一特异性条带,这与两条分子的DNA序列的大小501bp相符;菌体PCR表明成功转化,为阳性克隆;重组质粒经DNA序列测定表明,其核苷酸序列和预期结果一致,证实三段基因均正确插入质粒中,成功构建重组表达质粒。 2、IFNα-2b及其两突变体蛋白的表达及纯化 含有重组质粒的大肠杆菌BL21(DE3)经小量培养后,采用摇瓶培养大量制备IFNα-2b及其突变体蛋白。摇瓶培养结束后离心收集并洗涤菌体,采用超声破菌的方式获得包涵体。包涵体经洗涤、增溶后,用7mol/L的盐酸胍变性,用硼酸盐缓冲液复性,复性液透析后,先后经阴离子交换层析和阳离子交换层析,得到较纯的IFNα-2b及其突变体蛋白。 用15%还原性SDS-PAGE电泳检测表达量,目的蛋白的表达量大于40%,主要以包涵体的形式存在,表达产物的分子量在20KDa左右,这与IFNα-2b的理论分子量相符。经15%非还原性SDS-PAGE电泳检测表明纯度在95%以上。 3、IFNα-2b及其突变体的质量检测 IFNα-2b突变体的分子量采用基质辅助激光解吸附飞行时间质谱法测量;IFNα-2b及其突变体的浓度采用Lowry法测定;采用细胞病变抑制法(CPE)测定IFNα-2b及其突变体的生物活性,计算其比活性。 结果IFNα-2bHis~(58)的分子量为19239.98,与其理论分子量完全相符;IFNα-2b比活性大于1.68×10~8IU/mg、IFNα-2bHis~(58)比活性大于3.46×10~8IU/mg、IFNα-2bHis~(89)/His~(159)的比活性大于2.80×10~8IU/mg。由测活结果得知IFNα-2bHis~(58)的活性较突变前提高一倍多,IFNα-2bHis~(89)/His~(159)的活性也较突变前有所提高。 4、IFNα-2b及其突变体的初步药代动力学试验 以SD大鼠进行初步药代动力学研究,三种IFN各为一组,每组六只大鼠,经皮下注射给药2.5×10~7IU/kg,按设计好的时间点经鼠尾静脉取血,用CPE法检测各血清样品中IFN的保留活性,绘制血药活性-时间曲线,采用DAS软件进行数据拟合,分析药代动力学参数。 结果表明IFNα-2b的t1/2β为1.72h,IFNα-2bHis~(58)的t1/2β为2.30h,IFNα-2bHis~(89)/His~(159)的t1/2β为2.34h,半衰期较突变前略有延长。 结论 1、本研究采用分子生物学、生物信息学和计算机辅助设计的办法设计了2条IFNα-2b突变体分子,成功构建了IFNα-2b突变体基因,并完成了工程菌构建。 2、确定了IFNα-2b突变体的培养条件,包涵体的表达量在40%以上。 3、摸索到了IFNα-2b突变体的分离纯化工艺,流程简单,得率较高,纯度达到95%以上。为IFNα-2b的生产探索到了简单的方法。 4、IFNα-2b突变体蛋白经CPE法测活,证实突变后生物活性大于未突变的IFNα-2b,获得了高性能的新分子。 5、IFNα-2b突变体的体内稳定性得到了改善,证实了通过IFNα-2b自身分子改造,置换蛋白酶的酶切位点这一方法来实现长效目的的可能性,为进一步摸索重要酶切位点提供了理论依据及实验依据。


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