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干扰素-α对转化生长因子-β_1刺激肝星状细胞表达Smad3及Smad7的影响

靳慧斌  
【摘要】: 目的 肝纤维化是多种慢性肝病共有的组织学变化,肝星状细胞(HSC)的活化和增殖是肝纤维化形成的关键和中心环节。转化生长因子-β_1(TGF-β_1)是调控肝纤维化发生、发展的核心物质。Smads蛋白是TGF-β信号转导过程中最重要的胞内效应因子,它能将TGF-β信号由胞膜转入核内。Smad3过度表达及Smad7被抑制是肝组织纤维化的主要原因。IFN-α具有抗肝纤维化的作用。至于IFN-α对TGF-β/Smad信号转导通路中Smad蛋白家族是否有影响尚未见报道。本研究通过检测IFN-α对TGF-β_1刺激体外培养的HSC表达Smad3与Smad7的动态变化,探讨IFN-α对TGF-β_1刺激体外培养的HSC表达Smads蛋白的影响,阐明其抗肝纤维化机制,为临床肝纤维化的药物治疗提供更多的理论依据。 材料与方法 一、实验材料 1、大鼠肝脏星状细胞株(r-HSC99) 由北京大学人民医院冷希圣教授惠赠,由中国医科大学附属盛京医院感染科研究室保存。r-HSC99是经长期培养,传代后自发产生的,符合HSC的自然特征,是研究肝纤维化理想的实验模型。 2、主要试剂 TGF-β_1;重组人干扰素-α2b;β-actin引物、Smad3引物、Smad7引物、逆转录试剂盒;羊抗大鼠Smad3多克隆抗体;羊抗大鼠Smad7多克隆抗体。兔抗山羊IgG抗体。 二、实验方法 体外培养大鼠肝星状细胞系r-HSC99,分为TGF-β_1组、TGF-β_1+IFN-α组。分别应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法和免疫印迹(Western blotting)方法,测定各组于培养0、2、4、8、16、24小时,HSC表达Smad3、Smad7的mRNA及蛋白变化。 三、统计学处理 应用SPSS13.0软件进行分析,数据以均数±标准差表示,各组之间是否存在显著性差异分析采用LSD-t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。 实验结果 1、HSC表达Smad3、Smad7 mRNA的结果 0小时的Smad3 mRNA/β-actine值为0.524±0.022,TGF-β_1组2、4、8、16、24小时Smad3 mRNA/β-actine值分别为0.591±0.039、0.761±0.023、0.896±0.033、0.779±0.020、0.648±0.037;IFN-α+TGF-β_1组2、4、8、16、24小时Smad3mRNA/β-actine值分别为0.562±0.038、0.593±0.033、0.705±0.031、0.647±0.020、0.579±0.024。在TGF-β_1作用下,随着时间的增加,两组Smad3 mRNA表达均增加,在8小时达到高峰,之后开始下降,与0小时相比,Smad3 mRNA在4、8、16、24小时组差异均有统计学意义(P<0.05);IFN-α+TGF-β_1组与TGF-β_1组按时间相比,IFN-α+TGF-β_1组Smad3 mRNA表达低于TGF-β_1组,在4、8、16小时组差异均有统计学意义(P<0.05)。 0小时的Smad7 mRNA/β-actine值为0.513±0.135,TGF-β_1组2、4、8、16、24小时Smad7 mRNA/β-actine值分别为0.604±0.034、0.764±0.022、0.855±0.027、0.775±0.032、0.668±0.033;IFN-α+TGF-β_1组2、4、8、16、24小时Smad7mRNA/β-actine值分别为0.672±0.029、0.949±0.038、1.126±0.026、0.933±0.015、0.631±0.088。随着时间的增加,两组Smad7 mRNA表达均增加,在8小时达到高峰,之后开始下降,与0小时相比,Smad7 mRNA在4、8、16小时组差异均有统计学意义(P<0.05);IFN-α+TGF-β_1组与TGF-β_1组按时间相比,IFN-α+TGF-β_1组Smad7 mRNA表达高于TGF-β_1组,在4、8、16小时组差异均有统计学意义(P<0.05)。 2、HSC表达Smad3、Smad7蛋白的结果 0小时的Smad3蛋白/β-actine值为0.291±0.031,TGF-β_1组2、4、8、16、24小时Smad3蛋白/β-actine值分别为0.321±0.055、0.393±0.034、0.569±0.035、0.556±0.034、0.395±0.022;IFN-α+TGF-β_1组2、4、8、16、24小时Smad3蛋白/β-actine值分别为0.307±0.072、0.390±0.029、0.451±0.027、0.433±0.0220.330±0.026。在TGF-β_1作用下,随着时间的增加,两组Smad3蛋白表达均增加,在8小时达到高峰,之后开始下降,与0小时相比,Smad3蛋白在4、8、16、24小时组差异均有统计学意义(P<0.05);IFN-α+TGF-β_1组与TGF-β_1组按时间相比,IFN-α+TGF-β_1组Smad3蛋白表达低于TGF-β_1组,在4、8、16小时组差异均有统计学意义(P<0.05)。 0小时的Smad7蛋白/β-actine值为0.18±0.010,TGF-β_1组2、4、8、16、24小时Smad7蛋白/β-actine值分别为0.201±0.014、0.270±0.043、0.422±0.035、0.330±0.042、0.259±0.027;IFN-α+TGF-β_1组2、4、8、16、24小时Smad7蛋白/β-actine值分别为0.182±0.011、0.303±0.031、0.528±0.049、0.437±0.0370.304±0.030。随着时间的增加,两组Smad7蛋白表达均增加,在8小时达到高峰,之后开始下降,与0小时相比,Smad7蛋白在4、8、16、24小时组差异均有统计学意义(P<0.05);IFN-α+TGF-β_1组与TGF-β_1组按时间相比,IFN-α+TGF-β_1组Smad7蛋白表达高于TGF-β_1组,在8、16小时组差异均有统计学意义(P<0.05)。 结论 1、TGF-β_1可刺激r-HSC99表达Smad3 mRNA及蛋白增加,且具有时间依赖关系。 2、TGF-β_1可刺激r-HSC99表达Smad7 mRNA及蛋白增加,且具有时间依赖关系。 3IFN-α可分别在mRNA和蛋白水平抑制TGF-β_1刺激r-HSC99表达Smad3,促进TGF-β_1刺激r-HSC99表达Smad7,进而抑制肝纤维化的进展。


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