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大鼠脑挫伤后PSD-95表达变化的时间规律性研究

梁红霞  
【摘要】: 脑是人体的生命中枢器官,也是暴力损伤中极易受累的器官,因而脑挫伤是法医学鉴定工作中常见的损伤类型。脑挫伤形成机制、脑挫伤时间推断、脑挫伤程度判断一直受法医学工作者重视。由于国民经济高速发展,建筑业和交通运输业的兴起,创伤性脑损伤的发生率在近几年逐年增高,居创伤首位,是青壮年人群首要死亡原因。目前,关于脑挫伤转归机制尚不完全清楚,有许多理论学说,包括钙离子超载、微循环障碍等学说,然而依据相应的理论学说研究出的治疗方法鲜有可通过Ⅲ期临床实验,应用于临床治疗。脑挫伤是法医学工作中常见的损伤类型,推断脑挫伤时间对刑事案件的侦查及审判具有重要意义,然而准确推断脑挫伤时间一直是法医学中的难题,至今尚未圆满解决因此,有必要进一步研究脑挫伤的分子机理及找出相应的指标,为临床诊治和法医鉴定提供理论依据。 材料与方法 一、动物模型的制作,分组与对照 成年雄性SD大鼠50只,体重200-250g,由中国医科大学实验动物部提供。随机分为9组,每组5只,其中8组为实验组,1组为对照组,其余实验组采用吴旭等研制的大鼠脑挫伤模型制作方法,制造大鼠脑挫伤模型。大鼠称重后,乙醚吸入预麻醉,2%戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔注射麻醉。正中切开大鼠项部头皮,在人字缝前3mm,矢状缝旁3mm处钻直径为5mm的圆形骨窗,保持硬脑膜完好。采用自由落体打击装置,以30g重锤从25cm高处落下,打击暴露的脑组织。术后动物分笼饲养,保持垫料清洁及空气通畅。于伤后3h、6h、12h、1d、3d、5d、7d和10d将大鼠麻醉后脱颈椎处死,手术取出脑组织,沿冠状方向将挫伤区平均分为两部分,一部分用于免疫组化染色,另一部分用于Western blot检测。 二、免疫组织化学染色 脑组织经4%多聚甲醛固定后,水洗,梯度酒精脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,制作5μm厚度切片。采用链霉素.生物素法(SP法)进行免疫组化染色,并用苏木素复染细胞核,具体步骤同试剂盒说明书。PSD-95抗体1:400稀释,4℃孵育过夜。染色过程中另以PBS替代一抗,作为阴性对照。同时进行常规HE染色。山羊抗大鼠PSD-95多克隆抗体购自北京博奥森公司,SP免疫组织化学试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。 三、Western blot检测 提取脑组织蛋白并进行蛋白定量,聚丙烯酰胺凝胶电泳,湿转法转印,5%脱脂牛奶封闭,一抗(1:200稀释)、二抗(1:2500稀释)孵育后,ECL显色。实验中以GAPDH为内参。 实验结果 一、免疫组织化学染色结果 对照组神经细胞胞浆中可见少量PSD-95阳性染色。实验组中,脑挫伤后3h,挫伤周边区神经细胞中阳性细胞数增多;伤后6h,阳性细胞数继续升高;伤后12h组阳性细胞数与伤后6h组相似;伤后1d,PSD-95阳性细胞数下降;伤后3d,PSD-95阳性细胞数降至正常水平;伤后5d,阳性细胞数再次达到高峰;伤后7d,SD-95阳性细胞数开始减少;伤后10d,阳性细胞继续减少。 二、Western blot结果 对照组仅见少量PSD-95的表达;挫伤后3h-6h,出现PSD-95表达缓慢升高,12h达高峰,1d后下降,3d降至约正常水平,5d时又再次升高并达到高峰,以后逐渐下降。应用Fluorchem V 2.0 Stand Alone软件获取感光条带的平均光密度值,经统计分析,差异有统计学意义(P<0.05)。 结论 本实验在建立大鼠脑挫伤模型的基础上,应用免疫组织化学染色、Western blot方法检测大鼠脑挫伤后PSD-95表达情况,结果表明: 1、正常大鼠脑组织有少量PSD-95的表达。 2、PSD-95在脑挫伤后3-12h在挫伤周边区表达开始增多,3d后降至约正常水平,5d再次升高,后缓慢下降,呈双峰改变。 3、大鼠脑挫伤后PSD-95表达呈时间规律性变化。


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