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人正常晶状体蛋白质表达谱的构建和生物信息学分析

姚志斌  
【摘要】:前言 眼晶状体几乎是完全透明的器官,它能够让足够的光通过。晶状体呈双凸透镜状,能使光线准确地聚焦在视网膜上,就像照相机镜头一样,通过睫状肌的收缩或放松使我们清楚地看远和看近。晶状体还能过滤一部分紫外线来保护视网膜。因此,晶状体在眼屈光系统中发挥着重要的作用。晶状体的主要成分是蛋白质,晶状体蛋白受到干扰时很容易使晶状体变为不透明。晶状体蛋白质保持其正常的生理机制仍然是不解之谜。以往对晶状体的研究往往集中在在单个蛋白质上。但是蛋白质不是孤立的、静止的,它们需要复杂的信号,复杂的蛋白质相互作用网络来适应内部和外部的环境变化。各种高通量蛋白质组技术的出现使获知晶状体蛋白质的完整信息成为可能。液相色谱联合串联质谱法(LC-MS/MS)是高通量蛋白质组学研究的最流行方法之一,特别是LTQ线性离子阱串联质谱仪,它已成为公认的功能强大的质谱仪,具有高的扫描率,高容量和高的离子捕集效率。信息科学已应用于生物学领域,所产生的学科称为生物信息学。生物信息学将生物数据和计算机技术有机地结合起来,这为分析蛋白质组中庞大而复杂数据带来极其便利的条件。因此,近年来,先进的生物信息学工具已经迅速发展成为用于蛋白质组学领域中数据分析的一个重要的助手,其中许多生物信息学工具可通过万维网获得。 方法 首先将完整的晶状体样品(包括完整的晶状体囊膜)进行预分离来减少样品复杂程度。将晶状体样品加液氮反复研磨成粉末。晶状体粉末中加入Tris-HCL缓冲液50mM(调PH值为7.4),并加入0.01%DTT、广谱蛋白酶抑制剂(ProteaseInhibitor Cocktail Set I,含500uM AEBSF-Hcl;150nM Aprotinin;1uM E-64;0.5MmEDTA Na_2;1uM Leupeptin)匀浆,以30000g离心60min,收集上清液;剩余沉淀仍按上述步骤进行操作,如此反复三次,合并三次上清液主要为晶状体水溶性蛋白质成分。剩余的沉淀物将其再溶于裂解缓冲液(7M尿素,2M硫脲,4%CHAPS,50mM Tris-HCL pH 7.4)中,超声匀浆(超声180s),依然按上述方法离心,收集上清液,重复上述步骤三次,合并三次上清液主要为晶状体水不溶性蛋白质成分1,剩余沉淀物再溶于4%SDS,3%巯基乙醇,50mM Tris-Cl(pH8.8)的缓冲液中煮沸5分钟,超声匀浆,依然按上述方法离心,收集上清液,重复上述步骤三次,合并三次上清液主要为晶状体水不溶性蛋白质成分2,最终将剩余的少量沉淀物弃去。 应用BradFord法(使用牛血清白蛋白BSA作为标准蛋白)对晶状体水溶性蛋白质成分、水不溶性蛋白质成分1进行蛋白定量后,加入SDS-PAGE上样缓冲液(50mmol/l Tris-HCl,pH 8.3,2%SDS,5%β-巯基乙醇和5%甘油)95℃加热5min。配置12%SDS-PAGE不连续聚丙烯酰胺凝胶(浓缩胶5%,分离胶12%)初步分离晶状体蛋白质:晶状体水溶性蛋白质成分和晶状体水不溶性蛋白质成分1,每泳道各上样量为15μg。水不溶性蛋白溶液2直接上样。电泳电流30—45mA,电压80—120mV,溴酚蓝到达胶的底端附近(0.5-1cm)停止电泳。采用考马斯亮蓝R-250染色,染色后SDS-PAGE胶图及切胶位点见附图3,将每个条带的胶分别切成约1mm的小块,分别放于微量离心管中(碳酸氢氨:乙腈1:1)脱色,加乙腈使胶块脱水,然后加DTT在56℃下加热30分钟还原样品,再加碘乙酰胺烷基化在暗处30分钟,冻干,加入测序级胰蛋白酶溶液(0.1mg/ml),于37℃水浴酶解16个小时,以三氟乙酸(TFA)水溶液提取酶解肽段。 酶解肽段分别用辅助泵以30μL/min的流速由自动采样器首先进样到300μmi.d.×5mm Zorbax 300SB-C18预柱(Agilent Technologies,Wilmington,DE)上除盐20min,然后切换到75μm i.d.×150mm RP-C18分析柱(毛细管反相柱,ColumnTechnology Inc.)进行线性梯度洗脱,流速设定为2.0μL/min,流动相A液为0.1%甲酸的水溶液,流动相B液为0.1%甲酸的乙腈水溶液(乙腈为84%);0~45分钟,4%~50%B液;45~54分钟,50%~100%B液;54~120分钟,B液维持在100%。 分离后的馏分通过ESI源进行LTQ线性离子阱串联质谱分析,ESI源喷雾电压:3.0kV,毛细管温度:160℃,采用正离子模式,离子阱特有的自动增益控制(AGC),可以有效控制阱内离子的数目,MS全扫描A GC设定为3×10~4,MS/MS扫描A GC设定为1×10~4,最高离子累积时间:MS模式为50ms,MS/MS模式为100ms。采用标准化35%的碰撞能量,一次全扫描选定10个最丰富的碎片离子检测。 得到的原始数据处理采用TurboSEQUEST算法(存在于BIOWORKS3.1软件包中)搜索相应的人类数据库。除了具有两个或两个以上的独特的肽段被认为是鉴定的结果,具有一个独特的肽段也被认为是鉴定的结果。搜索使用的数据库为IPI HUMAN v3.36蛋白库,采用TurboSEQUEST算法筛选结果,过滤参数为:当肽段所带的Charge为+1,Xcorr≥1.9,当肽段所带Charge为+2,Xcorr≥2.2,当肽段所带Charge为+3,Xcorr≥3.75:DeltCn≥0.1。利用反转库估计蛋白质组数据假阳性率,假阳性率FPR<0.05。 采用基因本体论GO(http://www.geneontology.org)对经鉴定的晶状体蛋白质功能进行分类,晶状体蛋白质在分子功能(Molecular function)、生物过程(Biological process)与细胞组成(Cellular component)三个部分的功能注释与人体总的蛋白功能注释大背景作(IPI_Human,versions 3.36,50145 protein sequences)比对,使用Gossip软件包来确定鉴定出的蛋白一些功能表达是否独立于人体总的蛋白功能注释大背景之上而为特定组织的功能表达。 采用日本京都基因和基因组百科全书KEGG Pathway研究经鉴定的晶状体蛋白质参与的生物学通路。数据库为(http://www.genome.ad.jp/kegg/pathway.html)。 采用晶状体蛋白质相互作用的信息是来自人类蛋白质相互作用数据库中实验已验证直接(物理)的相互作用,采用相互作用数据库为BIND(Webpage URL:http://www.bind.ca),BioGRID(Webpage URL:http://www.thebiogrid.org),EcoCyc(Webpage URL:http://www.ecocyc.org),HPRD(Webpage URL:http://www.hprd.org). 结果 共鉴定出人正常晶状体蛋白质及其亚基939个,具有两个或两个以上的独特的肽段蛋白质及其亚基有214个,具有一个独特的肽段鉴定的蛋白质及其亚基有725个。 在鉴定的939个晶状体蛋白质及其亚基中,酶蛋白173个,鉴定出许多参与内源性抗氧化系统的酶类,氧化还原酶类,蛋白激酶类,磷酸酶类,转移酶类,异构酶,水解酶类。 许多蛋白亚型如14-3-3蛋白(α/β,γ,η,ε,ζ/δ),过氧化物酶基因(-1,-2,-4,-6),泛素蛋白连接酶(UBR1,UBR2)等被鉴定。 本实验鉴定出一些多功能蛋白,如β-连环蛋白,14-3-3蛋白,谷胱甘肽S转移酶,网格蛋白,3-磷酸甘油醛脱氢酶等。 本实验鉴定出多种细胞骨架蛋白:肌动蛋白,肌球蛋白,微管蛋白,网格蛋白,钙结合微丝蛋白,中心体肌动蛋白,filensin,phakinin,波形蛋白(vimentin),筑丝蛋白,[肌动蛋白]抑制蛋白,驱动蛋白,动力蛋白激活蛋白,锚蛋白,细丝蛋白,膜联蛋白,膜突蛋白,膜收缩蛋白,冠蛋白,微管相关蛋白,微管蛋白-肌动蛋白交联因子,β-连环蛋白,根蛋白,β-内收蛋白等。 分子量和等电点的信息来自蛋白质鉴定结果。分子量在20~40kDa范围内,晶状体蛋白质显示的数量最多,有212个,在40~60kDa范围内显示有189个,在0~20kDa范围内显示有113个;大于60kDa,晶状体蛋白质显示的数量逐渐递减,但在大于220kDa晶状体蛋白质显示的数量又出现一个小高峰,为63个;晶状体蛋白质分子量主要集中在20~60kDa范围内。鉴定出晶状体蛋白质等电点主要分布在5~7之间,为527(56.1%)个,其次8~10之间为295(31.5%)个,等电点在小于4和大于11,晶状体蛋白质亦有分布,为9(0.9%)和1(0.1%)。 从SWISS-RPOT数据库中提取了蛋白质定位信息,定位在细胞质上183个,定位在核上118个,定位在细胞膜上48个,定位在细胞上38个,与分泌有关的35个,定位在线粒体18个,定位在内(胞)浆的15个,定位在高尔基体上8个,定位在过氧化物酶体上4个,定位在中心体上2个,定位在溶酶体上1个,定位在空泡上1个,贯穿细胞膜1个,未知228个。 鉴定的晶状体蛋白质根据亲水性总平均值(grand average hydrophobicity,GRAVY)确定为亲水性还是疏水性蛋白,GRAVY值根据Kyte和Doolittle方法确定。870(92.7%)晶状体蛋白质GRAVY值为负值,69(7.3%)晶状体蛋白质GRAVY值为正值。GRAVY值为负值通常是亲水性蛋白,GRAVY值为正值通常是疏水性蛋白。 鉴定出的晶状体蛋白质有29项功能表达是独立于人体总的蛋白功能注释大背景之上而为特定表达。鉴定出的晶状体蛋白质参与细胞组成显示富集结果有:细胞内,细胞内部件,细胞质,细胞骨架,细胞溶质,细胞外基质,基膜,眼晶状体结构组成。鉴定出的晶状体蛋白质参与分子功能显示富集结果有:蛋白结合功能,结构分子活性。鉴定出的晶状体蛋白质参与生物过程显示富集结果有:分解代谢过程,细胞的分解代谢过程,细胞骨架结构和生物合成,细胞大分子分解代谢过程,碳水化合物代谢过程,乙醇代谢过程,细胞的碳水化合物代谢过程,单糖代谢过程,己糖代谢过程,细胞碳水化合物分解代谢过程,碳水化合物分解代谢过程,葡萄糖代谢过程,单糖分解代谢过程,乙醇分解代谢过程,己糖分解代谢过程,葡萄糖分解代谢过程,糖酵解,肌动蛋白丝长度调节,NADP代谢过程。本次研究数据未显示缺失的注释。 经鉴定的晶状体蛋白质参与的生物学通路(KEGG pathway):鉴定的晶状体蛋白质主要参与糖酵解代谢途径、磷酸戊糖代谢途径、果糖-甘露糖代谢途径、谷胱甘肽代谢途径、促分裂原活化蛋白激酶信号传导、磷脂酰肌醇信号系统、泛素介导的蛋白酶体系统和细胞周期。 在晶状体蛋白质相互作用网络图中:蛋白质有3个或以上节点的可能是晶状体蛋白质相互作用中重要蛋白,它们是网格蛋白,肌动蛋白,膜收缩蛋白(α,β),波形蛋白,14-3-3 protein(β/α,ζ/A,S,γ,η),TSC2蛋白,层粘连蛋白(γ-1),分裂原活化蛋白激酶,alpha-A-晶状体蛋白,热休克蛋白质(α,β),3-磷酸甘油醛脱氢酶,鸟嘌呤核苷释放蛋白-1,胶原蛋白Ⅳα-2。 结论 1、将人晶状体样品分为水溶性和水不溶性蛋白质两种组分,减少样品的复杂程度而有利于其在1D SDS-PAGE凝胶的分离而显示出清晰条带,并有助于后续质谱鉴定。 2、12%1D SDS-PAGE凝胶电泳对人正常晶状体蛋白质水溶性和水不溶性蛋白分离效果最佳。人正常晶状体中含有大量水溶性蛋白质。 3、通过液相色谱-新型线性离子阱串联质谱法对人正常晶状体蛋白质的分离检测,鉴定出大量人正常晶状体内低丰度蛋白、蛋白质亚基和未知蛋白,其中包含许多功能性蛋白,如酶类、多功能蛋白、细胞骨架蛋白等,一些蛋白质及蛋白质亚基为本实验首次从人正常晶状体中得到鉴定,极大丰富了人晶状体蛋白质数据库。1D SDS-PAGE-反相液相色谱-新型的线性离子阱串联质谱法是鉴定人晶状体蛋白质的理想方法。 4、应用基因本体论(Gene Ontology,GO)对鉴定出人晶状体蛋白功能分析显示:晶状体结构组成,细胞骨架,细胞质,基膜,蛋白结合功能,结构分子的活性,糖酵解和NADP辅酶代谢等在人正常晶状体突出表现。 5、本研究通过KEGG pathway分析发现经鉴定的晶状体蛋白质参与的主要代谢通路为糖酵解代谢途径、磷酸戊糖代谢途径、谷胱甘肽代谢途径、促分裂原活化蛋白激酶、磷脂酰肌醇信号系统、泛素介导的蛋白酶体系统、细胞周期等。 6、本研究通过构建晶状体蛋白质相互作用网络图发现一些重要的蛋白质,它们是网格蛋白,肌动蛋白,膜收缩蛋白(α,β),波形蛋白,14-3-3蛋白(β/α,ζ/δ,ε,γ,η),TSC2蛋白,层粘蛋白γ-1,有丝分裂原激活蛋白激酶,alpha-A-晶状体蛋白,热休克蛋白(α,β),鸟嘌呤核苷释放蛋白,胶原蛋白Ⅳα和甘油三磷酸脱氢酶。 7、基因本体论(Gene Ontology,GO)和KEGG pathway等生物信息学工具有助于人晶状体蛋白质功能、代谢通路、相互作用等全面、快速、准确的分析。


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