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PDCD5基因在大肠癌中的表达及其对药敏的影响

刘艳萍  
【摘要】: 目的 PDCD5基因是北京大学人类疾病基因中心从白血病细胞系TF-1细胞中克隆得到的、具有自主知识产权的新功能基因。PDCD5基因在多种肿瘤如宫颈癌、肝癌、多发性骨髓瘤、胃癌、肺癌等疾病中表达下降,可能与其发生有关,但其在肿瘤癌变过程中所起的作用并不十分清楚。大肠癌是常见的消化道肿瘤,在肿瘤疾病发生发展过程中具有典型多阶段性。为了明确PDCD5基因在肿瘤发生发展过程的作用,我们选取在大肠癌变过程中的不同阶段的组织,以及大肠癌细胞系,分别从组织水平、细胞蛋白水平及mRNA水平明确PDCD5基因在大肠癌疾病不同阶段的表达,初步探讨其在癌变过程中的作用;同时对其临床预后做了随访调查,明确其临床意义。为了进一步探讨PDCD5基因在治疗方面的作用,我科成功构建了携带PDCD5基因的重组慢病毒载体;在本研究中,将上述重组载体转染结肠癌细胞系HCT116,使PDCD5基因过表达,进而检测转染前后HCT116细胞增殖能力和凋亡细胞比例的变化,期望能为肿瘤治疗提供新的方法。 方法 选取2007年12月-2008年12月经我院病理科确诊的46例大肠癌、20例腺瘤性息肉及28例慢性炎症患者的组织应用S-P免疫组化方法检测PDCD5基因在其中的表达,并与临床资料比较,对其中46例大肠癌患者进行电话随访预后。选取大肠癌细胞HCT116、HT29及人脐静脉内皮细胞Huvec,应用免疫细胞化学方法检测各细胞中PDCD5在蛋白水平的表达;RT-PCR方法检测其在mRNA水平的表达。在PDCD5的功能性研究方面,选择慢病毒作为载体,应用本室保存的携带PDCD5基因的重组慢病毒L-PDCD5及对照慢病毒空载体L-null,稳定转染大肠癌细胞系HCT116,并常规传代培养。化疗药物5-fu设定5个浓度诱导转染前后细胞凋亡,利用MTT法测定各组细胞增殖能力改变,计算出5-fu的半数抑制浓度;根据MTT结果,5-fu选定高低两个浓度诱导HCT116细胞凋亡,应用Annexin V/PI双染色流式细胞术测定各组细胞凋亡的变化,以明确PDCD5对于化疗药物的增敏作用。 结果 PDCD5在慢性炎症组织中表达最高,明显高于腺瘤性息肉及癌组织中的表达(x2=10.495,P0.05),但在腺瘤性息肉和癌组织、以及不同分级的大肠癌之间的表达无明显差异(P=0.552);随访病例中PDCD5表达高的患者,生存评分较高。PDCD5在人脐静脉内皮细胞株Huvec中表达高于结肠癌细胞株中的表达。目的基因PDCD5能被重组慢病毒L-PDCD5高效地导入靶细胞结肠癌HCT116细胞,转染率达80-90%,转染后细胞可以传代培养,荧光显微镜下能直接观察到绿色荧光存在,即PDCD5达到稳定的表达。RT-PCR能检测到转染后的靶细胞中PDCD5的表达明显高于未转染的细胞。MTT法结果显示L-PDCD5组细胞的抑制率在各个浓度显著高于L-null空载体组及单纯细胞组(P0.05)。流式结果示,低浓度组中,L-PDCD5组细胞凋亡率(24.74%)明显高于正常细胞组(13.25%)和L-null组(24.74%):高浓度组中,L-PDCD5组的细胞凋亡率(48.84%)也明显高于正常细胞组(34.59%)和L-null组(37.48%);且随着药物浓度增加,细胞凋亡率增加。 结论 PDCD5基因可能不同程度地参与了大肠组织细胞癌变过程的调控,特别在癌变早期作用较为明显;携带PDCD5基因的重组慢病毒载体转染大肠癌细胞系HCT116能够稳定表达;这种稳定表达,使大肠癌细胞对化疗药物更加敏感,并呈现浓度依赖性。


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