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原代培养大鼠皮质神经细胞缺氧糖损伤模型的建立及损伤后calpain1表达变化规律的研究

孙宏杰  
【摘要】: 目的 脑损伤是法医学鉴定工作中常见的损伤类型,脑损伤发生后的继发性神经细胞损伤的分子机制一直为各国学者所关注。以往关于脑损伤研究的模型存在脑损伤的力学特点不规则,同样的力造成不同动物脑损伤程度不一致及损伤影响范围不易控制等问题。而原代培养的神经细胞样本较均匀,可以较好地控制损伤方法和损伤程度,损伤后观察和检测也比较方便,尤其在进行某些损伤机制方面的研究有其明显的优越性,因此制作合适的神经细胞损伤模型对研究颅脑损伤的机制具有重要意义。 本实验成功建立了原代培养大鼠皮质神经细胞缺氧缺糖损伤模型,应用倒置显微镜及免疫荧光细胞化学染色技术观察神经细胞OGD损伤后的形态学变化,同时应用western blot方法检测神经细胞OGD损伤后calpain1及其底物map2在蛋白水平上表达随时间变化的情况,研究calpain1在脑损伤后继发性神经细胞损伤中的作用,并对calpain1及map2表达变化的时间规律在推断脑损伤形成时间方面的应用进行了探讨。 实验材料与方法 选择出生后1-2天的Wistar仔鼠,取大脑皮质组织,剪碎,体积分数为0.25%的胰酶消化,终止反应,离心,沉淀细胞用含15%马血清及1%B27的DMEM/F12培养基悬浮,过滤使之成为单细胞悬液,按2×106个/ml种植于预先包被多聚赖氨酸的六孔培养板中(免疫荧光细胞化学染色需预先在六孔板内放置无菌盖玻片),置于细胞培养箱中培养。2天后加终浓度10μmol/L阿糖胞苷抑制胶质细胞的生长。神经细胞培养至第7天时,随机分为1个对照组及4个损伤组,损伤组神经细胞用含0.5mmol/L连二亚硫酸钠的低糖DMEM培养基进行缺氧缺糖损伤30min,损伤后换原培养基分别继续培养1h、6h、12h、24h。对照组只常规换液一次。对照组及损伤组神经细胞分别进行活细胞倒置显微镜观察、免疫荧光细胞化学染色和western blot检测。 结果 本实验应用连二亚硫酸钠加低糖培养基成功制作了原代培养大鼠皮质神经细胞缺氧缺糖损伤模型,通过活细胞倒置显微镜观察和免疫荧光细胞化学染色发现神经细胞缺氧缺糖损伤后24h内形态学发生了一系列改变。对照组神经细胞形态较好,胞体丰满,呈椭圆形或多极形,树突、轴突较长并相互交织。OGD损伤1h后,大部分神经细胞仍保持原有形态,少数细胞突起缩短。伤后6h、12h,神经细胞胞体明显皱缩,多数细胞突起缩短,甚至消失。伤后24h,神经细胞形态部分恢复,胞体变圆,部分突起重新出现。 Western blot结果显示calpain1及其底物map2在大鼠皮质神经细胞中有表达。神经细胞缺氧缺糖损伤后1h、6h、12h、24h, calpain1和map2蛋白表达强度改变有一定规律。与对照组相比,calpain1蛋白水平在OGD损伤后1h、6h、12h、24h表达均增强,其中伤后6h、12h组calpainl表达处于较高水平,伤后24h组calpain1表达高于1h组。与对照组相比,map2蛋白水平在OGD损伤后1h、6h、12h、24h表达均降低,其中伤后6h、12h组map2表达处于较低水平,伤后24h组map2表达低于1h组。 结论 1、本实验应用连二亚硫酸钠加低糖培养基成功地制作了原代培养大鼠皮质神经细胞OGD损伤模型。 2、大鼠皮质神经细胞OGD损伤后calpain1及其底物map2的表达水平存在一定的时间变化规律。 3、calpain1及map2此种变化规律可用于法医学实践中推断脑损伤形成时间。


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