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EMT机制在胆道闭锁患儿胆管纤维化改变中作用的探讨

胡婷嫣  
【摘要】: 目的 胆道闭锁(biliary atresia, BA)是婴儿期引起胆汁淤积性黄疸的一种常见疾病,严重危及婴幼儿生命。其发病率为1/14000-1/10000。临床上常与新生儿特发性肝炎难鉴别。尽管随着Kasai手术的广泛开展,使胆道闭锁患儿获得更多的生存机会,但在术后十年的生存率仅为10-20%,而且有70%-80%的患儿有进行性的胆管破坏和肝纤维化,最终需要肝移植。BA病因至今尚不清楚,越来越多的人认为围生期病毒感染在BA的发生中起重要作用,而病毒感染通过哪些途径导致胆管进行性炎症、退化及肝纤维化目前尚不清楚。 目前、研究认为在组织器官慢性纤维化中,上皮间充质转化(epithelium-mesenchymal transition, EMT)机制发挥着至关重要的作用,EMT是指分化成熟的极化上皮细胞丧失上皮/内皮细胞特征,向间充质细胞转化,使其具有更大的活性和迁移性,这一过程在胚胎发育、组织再生、组织器官纤维化、癌细胞的转移中发挥重要作用。生理状态下,EMT是组织器官重要的创伤修复机制,组织器官损伤后通过EMT机制形成纤维瘢痕达到创伤修复,但这一过程持续存在则为病理状态,可造成组织器官纤维化、硬化,这种转化机制在毛细支气管、肾小管等管状组织纤维化中的研究较早、报道较多,而且最近EMT已经成为终止、逆转肾脏损伤后肾小管进行性纤维化的重要治疗靶点。最近有研究认为EMT可能是参与BA中硬化性胆管炎的重要病理机制,在此过程中胆管上皮细胞逐渐丧失上皮细胞特性,并逐渐表现出间充质细胞特性,一系列重要的细胞因子CK-19、Fibronectin、TGF-β、Smad3和Hes-1等也参与了这一重要的病理过程。CK-19为胆管细胞特异性细胞因子,可直接反应胆管上皮细胞形态及数量的变化;研究表明,Fibronectin为间充质细胞特异性细胞因子,能直接影响细胞骨架成分的形成与组装[7],增强细胞与细胞间、细胞与基质间的粘附能力,在正常肝脏组织上皮类细胞中不表达,若在BA患儿肝脏上皮类细胞中表达,则可作为EMT机制激活的早期信号;转化生长因子TGF-β1是体内作用最强和最广泛的影响纤维产生的细胞因子[8],通过TGF-β、smad信号通路使纤维化过程持续并进一步恶化[9-10];Hes-1为胚胎发育过程中Notch信号通路的重要下游信号,与先天性发育异常有密切关系,Hes-1的表达受Notch信号的调节[11]。但上述指标在胆道闭锁患儿肝脏组织胆管纤维化过程中是否起作用,又发挥着怎样的作用等问题目前仍不清楚。因此本文从胆管上皮细胞是否发生间充质转化、是否伴有纤维化等炎症因子的参与、是否伴有胚胎发育信号的激活三方面综合分析,对BA患儿胆管病理改变规律进行深入研究,为进一步探索新的治疗方法奠定基础。 本研究以经手术证实为BA患儿的肝脏病理标本和无肝胆系统畸形的同年龄段尸检患儿肝脏标本为研究对象,采用免疫组织化学染色方法观察CK-19、Fibronectin、TGF-β1、Smad3和Hes-1在肝脏组织中表达和分布情况,探讨EMT机制在BA中发挥的作用,了解BA早期患儿肝脏组织胆管的病理变化规律,为深入了解BA患儿肝脏组织的病理演变规律提供重要实验依据。 方法 一、标本制备及分组 经术前超声、MRCP、术中所见、术中胆道造影证实为BA患者25例为病例组,术中无菌取活检肝组织约0.5cm×0.5cm×0.5cm大小病理标本,用4%多聚甲醛固定;对照组为无肝胆系统畸形的同年龄段尸检患儿5例,取肝组织,并用4%多聚甲醛固定。 二、免疫组织化学技术 应用免疫组织化学方法分别检测CK-19、Fibronectin、TGF-β、Smad3和Hes-1在对照组和病例组肝脏组织标本中的分布和表达情况。 三、数据分析 采用SPSS11.0软件进行统计分析。计量数据以x±s表示,数值比较采用t检验分析。P0.05为差异有统计学意义。 结果 1、胆管上皮细胞特异性细胞因子CK-19在BA组肝脏组织免疫组化染色中表达显著,大量毛细胆管增生,胆管失去正常管腔结构,无固定形态,部分胆管上皮细胞表型丧失,形态不一,分布紊乱,且有胆汁淤积的胆管管腔结构变化明显,胆管上皮细胞形态变化严重。CK-19在病例组肝脏组织免疫组化染色中,平均胆管上皮阳性细胞数(96.33±3.28个/HP),多于对照组(20.58±1.15个/HP),平均光密度为0.413±0.058,高于对照组0.264±0.021,与对照组相比,P0.001,其差异有统计学意义。 2、纤维化早期指标Fibronectin在BA组肝脏组织免疫组化染色中,肝细胞间、汇管区纤维组织及胆管上皮细胞均有表达,但在胆管上皮细胞表达显著。Fibronectin在病例组肝脏组织免疫组化染色中,平均胆管上皮阳性细胞数为57.24±2.08个/HP,多于对照组的0个/HP,P0.001,病例组平均光密度为0.305±0.078高于对照组,对照组为0.093±0.001,P0.001,其差异有统计学意义。 3、转化生长因子TGF-β1在BA患儿肝脏组织免疫组化染色中染色部位广泛分布于肝细胞、胆管上皮细胞、门管区部分纤维结构及周边其它细胞内,且肝细胞与周围组织结构染色更加明显,较胆管上皮细胞表达强烈。TGF-β1在病例组肝脏组织染色中,平均胆管上皮阳性细胞数(85.16±2.65个/HP),多于对照组(20.25±1.78个/HP),平均光密度为0.396±0.030,高于对照组0.241±0.021,与对照组相比,P0.001,其差异有统计学意义。 4、Smad3在BA患儿肝脏组织免疫组化染色中,肝细胞及胆管上皮细胞均存在,且胆管上皮细胞染色明显强于肝细胞,汇管区血管平滑肌细胞亦可呈轻度染色。Smad3在病例组肝脏组织免疫组化染色中,平均胆管上皮阳性细胞数(69.33±2.08个/HP),多于对照组(11.53±2.15个/HP),平均光密度为0.398±0.035,高于对照组0.254±0.028,与对照组相比,P0.001,其差异有统计学意义。 5、Hes-1在BA患儿肝脏组织免疫组化染色中,胆管上皮细胞染色明显强于对照组,染色主要位于细胞胞浆,较多上皮细胞表现为间充质细胞表型,相邻细胞之间相互融合,分布紊乱。Hes-1在病例组肝脏组织免疫组化染色中,平均胆管上皮阳性细胞数(81.58±2.38个/HP),多于对照组(12.97±2.73个/HP),平均光密度为0.408±0.063,高于对照组0.231±0.015,与对照组相比,P0.001,其差异有统计学意义。 结论 1、BA早期患者肝脏组织内大量毛细胆管及胆管上皮细胞增生,结构、形态及分布紊乱。 2、增生的胆管上皮细胞发生了上皮间充质转化,EMT在胆管纤维化中发挥重要作用。 3、在胆管上皮细胞EMT过程中伴有胚胎发育相关基因信号通路Notch下游通路重新激活,并且伴有炎症相关因子TGF-β1、Smad3等的激活、表达。


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