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Erp57在先天性脊柱裂和肛门直肠畸形胎鼠脊髓中表达的研究

康利娜  
【摘要】: 目的 先天性脊柱裂、先天性肛门直肠畸形均为常见的小儿先天性畸形,发病率分别为1‰-5‰、0.2‰-0.7‰,中国发病率明显高于西方国家。先天性脊柱裂和先天性肛门直肠畸形均为多基因遗传病,是遗传因素和环境因素共同作用的结果。但是,这些畸形的具体发病机制尚不清楚,病理改变复杂,而且没有良好的预防和治疗措施。因此,研究这些畸形的胚胎发生规律,可以为畸形的早期治疗和预防提供必要的前期基础。 关于这些先天畸形的发生机制的研究一直是国内外倍受关注的热点课题。经过一系列研究证实先天性肛门直肠畸形大多数存在明显的腰骶部脊髓神经发育异常。利用药物致畸制作动物模型过程中我们也发现维甲酸和乙烯硫脲均可同时产生先天性脊柱裂、先天性肛门直肠畸形这两种畸形。目前发现的畸形相关基因中Hox、SHH和Gli3基因是先天性脊柱裂和先天性肛门直肠畸形的共同相关基因。许多研究已经证实口服叶酸可以预防神经管畸形的发生,同时也能减少肛门直肠畸形和四肢畸形的发生。因此,我们提出一个新的假设:先天性脊柱裂、先天性肛门直肠畸形可能存在共同的发生机制,它们的发生可能都是与胚胎期脊髓神经发育异常有关。 蛋白质组学是指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴学科,目的是从整体水平分析细胞内动态变化的蛋白质结构、表达水平与翻译后修饰、细胞内定位,了解蛋白质之间的相互作用与联系,对蛋白质所执行的生理性、病理性生命活动做出最精细、最准确、最本质的阐述。蛋白质本身的存在形式、活动规律仍依赖于直接对蛋白质的研究来解决。因此,直接研究蛋白质的变化具有不可替代的意义。而且,随着蛋白质组学的研究进展,表达蛋白质组学是现今应用最为广泛的蛋白质组学研究模式,即利用双向电泳建立蛋白质图谱并对分离的蛋白质进行鉴定和分析。 由于患儿脊髓标本难以获取,因此建立先天性肛门直肠畸形及脊柱裂动物模型对其发病机制进行深入研究非常必要。我们在全反式维甲酸(ATRA)诱导大鼠模型的基础上,采用双向电泳技术对脊髓组织蛋白质进行分离,通过软件分析和质谱-生物信息学方法寻找疾病相关蛋白质,在蛋白质水平探讨两种畸形之间的共同发生机制,并对差异蛋白Erp57进行western-blot检测,为畸形的胚胎早期诊断和治疗提供基础资料。 方法 一、建立脊柱裂、肛门直肠畸形大鼠胚胎模型 1.将孕10d大鼠随机分为对照组和实验组,按135mg/Kg体重用灌胃法给予实验组大鼠,对照组给予相应体积橄榄油。 2.孕17d剖腹取出胚胎,取出脊髓组织(范围:第12胸椎下缘至脊髓末端)。 二、模型胎鼠与对照胎鼠脊髓组织蛋白质组差异分析 1.提取胎鼠脊髓组织的总蛋白质,Bradford法进行蛋白定量。 2.等电聚焦使用Ettan IPGphorⅡ等电聚焦仪。聚焦后的胶条经两步平衡后进行SDS-PAGE电泳,胶体考染、扫描后用ImageMaster 2D Platinum 6.0软件进行图像分析,寻找差异蛋白点。 3.切取差异点并进行质谱和生物信息学分析。 三、ERP57在模型鼠和对照胎鼠中表达情况分析 1.提取胎鼠脊髓组织的总蛋白质,Bradford法进行蛋白定量。 2.用western-blot方法验证该蛋白在脊髓中的表达情况,进一步分析Erp57与畸形的相关性。 结果 1、成功制作了脊柱裂、肛门直肠畸形胎鼠模型 孕17d剖检共获取胎鼠358只。对照组100只,维甲酸组中剖出存活胎鼠231只,死胎及吸收胎27只,其中单纯肛门直肠畸形组79只,肛门直肠畸形合并腰骶部显性脊柱裂组127只,隐形脊柱裂合并肛门直肠畸形7只,腹裂2只,其它畸形16只。对照组100只,无死胎及吸收胎。 2、模型组胎鼠和对照组胎鼠脊髓组织双向电泳图谱差异分析结果 使用pH4~7,24cm胶条获得了重复性较好的双向凝胶电泳考染图谱,对照组获得可识别平均斑点数为825±30个,单纯肛门直肠畸形组820±30个,肛门直肠畸形合并腰骶部显性脊柱裂组800±70个。在两种畸形中共同差异表达的蛋白点20个,表达趋势一致的共同差异点为17个,其中10个为表达上调的蛋白质,7个为表达下调的蛋白质。 3、差异点质谱鉴定及验证 选得界限清楚差异点20个,经质谱检测肽质量指纹谱质谱分析,1个点没有匹配数据库中的任何记录,共鉴定出19个蛋白点(见图3),由于蛋白翻译后磷酸化修饰等作用其中很多为重复蛋白,最后经数据库分析搜索出13种在两种畸形中表达趋势一致的蛋白,其中均下调的有7种蛋白,均上调的有6种蛋白。我们对其中表达上调明显的蛋白Erp57进行了western blot验证,结果显示模型鼠和对照鼠脊髓组织Erp57表达趋势与双向电泳结果一致(见图5),进一步证明了Erp57蛋白与先天性脊柱裂和肛门直肠畸形的相关性。 结论 1、应用双向电泳技术可以获得重复性较好的孕17d先天性肛门直肠畸形和脊柱裂模型胎鼠脊髓蛋白质双向电泳图谱。 2、应用双向电泳和质谱分析技术,发现Erp57等13种蛋白在先天性肛门直肠畸形和脊椎裂出现异常表达。


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