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暴发性肝衰竭大鼠脑中枢氨转运体基因表达的改变

汪照函  
【摘要】: 目的 暴发性肝衰竭(FHF)是一种以凝血酶原时间延长和肝性脑病为主要特征的临床疾病,肝性脑病作为其好发且致死性强的一种并发症,越来越得到人们的关注。目前研究表明,氨在致脑水肿致肝性脑病起了重要作用。因此研究氨进入脑中枢的机制以及在肝衰竭中其机制有否改变对将来可能阻滞氨的进入脑中枢有十分重要的意义。 氨转运体一类近来发现的一类专性转运氨的蛋白,在原核细胞、真菌类和哺乳动物都有表达,为一类AMT/MEP/RH蛋白。其在大鼠中表达为RhAG、RhD、RhBG和RhCG蛋白,在体内各器官起转运氨作用的为后两种蛋白。目前研究表明氨转运体蛋白在肾脏远端肾小管上皮细胞、集合管上皮细胞、睾丸精索上皮细胞、肝细胞、十二指肠上皮细胞和脑中枢都有表达。然而其机制和分布并不十分明朗。本研究的目的为制作一个有效的暴发性肝衰竭的模型,并研究氨转运体蛋白,包括RhBG蛋白和RhCG蛋白二者的基因在肝衰竭大鼠脑中枢基因表达的改变。 材料与方法 1、动物模型制备 实验动物为28只雄性Wistar大鼠,随机分为4组。1组:800mg/KgD-GaLN和10μg/Kg LPS联用ip组,10只;2组:400mg/Kg D-GaLN和100μg/Kg LPS联用ip组,5只;3组:800mg/Kg D-GaLN和100μg/Kg LPS联用ip组,5只;4组:400mg/Kg D-GaLN和16μg/Kg LPS联用iv组,8只。 2、血清ALT水平的测定 应用生物化学方法检测血清ALT水平,以明确暴发性肝衰竭时肝脏功能生化学改变。 3、大鼠生存曲线的建立记录各组大鼠24小时死亡率和死亡时间,比较各组大鼠的生存曲线。 4、建立时间点爆发性肝衰竭动物模型 实验动物为40只雄性Wistar大鼠,随机分为6组,其中Oh 5只,2h 5只,6h 5只,9h 5只,12h 10只,24h 10只。 5、实时定量PCR检测 应用Trizol试剂提取脑组织RNA,利用实时定量PCR对RhBG、RhCG mRNA的表达作相对定量分析。采用SYBR GreenI荧光染料嵌合法,以构建的RNA为标准品,分别对目的基因(RhBG、RhCG基因)和管家基因(GAPDH)制作标准曲线,利用标准曲线对样品中的目的基因和管家基因分别进行定量。通过管家基因的校正,检测各种样品RhBG、RhCG基因mRNA的相对表达量。 6、数据处理 结果用平均数±标准差表示,并采用方差分析的方法,以P0.05为差异具有显著性。 实验结果 1、各组血清ALT水平及一般状况的的比较 LPS/Ga1N联合注射后动物除800m/KgD-GaLN和10μg/Kg LPS联用ip组各组大鼠都出现懒动,进食能力下降,各组动物终末时期ALT进行比较。2、3和4组ALT水平较1组明显升高有显著性差异(P0.01),2、3和4组之间无明显差异。2、3和4组大鼠肝脏出现出血性大块或亚大块肝坏死,病理改变类似暴发性肝衰竭,而1组大鼠其肝脏只有部分点状出血。 2、大鼠生存曲线的建立 2、3和4组大鼠出现了死亡,2组为20%,3组为40%,而4组达到了75%,1组大鼠无死亡。各组大鼠死亡时间集中在9到13小时之间。 3、肝组织HE染色 各组HE染色良好。1组肝组织结构完整,肝板排列整齐,可见轻微点灶状坏死及肝细胞肿胀。2组肝组织肝板排列轻度紊乱,多处点灶状坏死,肝细胞肿胀,少许嗜酸性变。3、4组FHF组肝板排列明显紊乱,肝血窦明显扩张淤血,多处点灶状坏死,周围肝组织可见大量红细胞浸染。 4、脑组织RhBG、RhCG mRNA的表达 各时间点大鼠模型建立后,检测目的基因的表达,发现RhBG、RhCG基因呈上升趋势,12小时为顶点,12小时点后呈下降趋势。其中9h、12h、24h各时间点与正常值差异有显著性(p0.05)。 结论 1、800mg/KgD-GaLN和10μg/Kg LPS联用ip组未造成明显暴发肝损伤模型,和800mg/Kg D-GaLN和10μg/Kg LPS联用ip组相比,其余三组ALT值差异较大,提示肝脏损伤严重,且出现大鼠死亡现象,400mg/Kg D-GaLN和16μg/KgLPS联用iv组大鼠死亡率高,大鼠肝衰竭现象明显,是暴发性肝衰竭模型给药的首选。 2、在大鼠暴发性肝衰竭模型中,氨转运体(RhBG、RhCG)基因表达呈上升趋势,在12小时到达顶峰,之后呈下降趋势。


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