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辅助性T细胞亚群在EAE小鼠早期视神经炎发病中的作用及β-榄香烯干预的实验研究

张荣伟  
【摘要】: 前方 视神经炎(optic neuritis,ON)是神经眼科临床最常见的疾病之一,是累及视神经的急性或亚急性炎症,原发性或特发性脱髓鞘性视神经炎(idiopathic demyelinated optic neuritis, IDON)是临床最为常见的类型,该类型的视神经炎和MS的发病密切相关,二者有共同的病理改变。流行病学研究表明70%的多发性硬化(multiple sclerosis, MS)病人存在视神经炎,10-20%的MS病人临床首发症状为视神经炎。特发性脱髓鞘性视神经炎的发病和MS一样呈逐年上升趋势,其治疗现状不容乐观。实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental allergic encephalomyelitis, EAE)动物模是研究MS发病机制及治疗最理想的动物模型。β-榄香烯是我国自行开发研制的国家二类非细胞毒性抗肿瘤药物,具有免疫调节的作用。临床研究发现榄香烯对多种肿瘤有确切的疗效,并且易于通过血脑屏障。鉴于ON的病理机制可能涉及与肿瘤相似的免疫调节紊乱,因此本研究通过髓鞘少突胶质细胞糖蛋白多肽(myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide35-55, MOG35-55)诱发的EAE小鼠模型来探索ON发病的神经免疫学机制及β-榄香烯的神经保护作用机制,为视神经炎的基础研究和临床视神经炎的治疗提供新的方法和实验依据。 第一部分 MOGEAE小鼠早期视神经的病理学改变及及轴索损伤的研究 目的 采用公认的MOG35-55诱发的实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠模型,观察EAE小鼠视神经早期病理学变化,为脱髓鞘性视神经炎的研究建立实验平台。 方法 使用人工合成的MOG35-55多肽在百日咳毒素(pertussis toxin, PTX)和完全福氏佐剂(Complete Freund's Adjuvant, CFA)辅助下免疫雌性C57BL/6小鼠制作EAE模型,观察模型的行为学变化(体重和临床评分)、组织学变化(苏木素-伊红染色、透射电镜)和免疫组织化学变化。 结果 1、行为学改变:免疫后14天左右,小鼠逐渐出现运动功能障碍,评分开始上升,在观察期内,小鼠体重总体趋势向上,临床症状明显时,体重也随之波动出现小幅下降。 2、形态学改变:免疫后7天、11天、15天、19天小鼠视神经逐渐出现明显的炎症反应及轴索髓鞘的不同程度的损伤。 3、免疫组织化学的改变:免疫后7天小鼠可见视神经轴索损伤(β-APP蛋白表达,与对照组比较,p0.05),免疫后11天β-APP蛋白表达明显(与对照组比较,p0.05),免疫后11天可见视神经髓鞘损伤(CNPase蛋白表达减少,与对照组比较,p0.05),免疫后15天CNPase蛋白表达明显减少(与对照组比较,p0.05),发病高峰期可见明显的轴索髓鞘损伤(与对照组比较均p0.05)。 第二部分 MOGEAE小鼠早期视神经辅助性T细胞因子及其转录因子的表达时程 目的 研究辅助性T细胞亚群Th1、Th2、Treg、Th17特异性细胞因子其转录因子在脱髓鞘性视神经炎早期发病中的表达时程,以明确EAE小鼠脱髓鞘性视神经炎的免疫反应启动及免疫炎症维持机制。 方法 通过ELISA、免疫组化及ReaL-time PCR技术观察不同时点(免疫后7天、11天、15天、19天)视神经辅助性T细胞亚群Th1、Th2、Treg、Th17特异性细胞因子其转录因子的蛋白及mRNA表达。 结果 1、ELISA检测:小鼠视神经内IL-17蛋白含量在免疫后11天明显增高(与对照组比较,p0.05);视神经内IFN-γ蛋白含量在免疫后19天增高明显(与对照组比较,p0.05);视神经内IL-4蛋白含量在免疫后19天明显下降(与对照组比较,p0.05)。 2、免疫组织检测:小鼠视神经FOXP3蛋白在免疫后11天表达明显下降,持续至免疫后19天(与对照组比较,p0.05)。 3、分子生物学检测:小鼠视神经IL-17与IFN-γ的mRNA表达及转录因子RORγt与T-beta mRNA的表达与其蛋白表达时点一致(与对照组比较,p0.05),FOXP3mRNA的表达在免疫后11天出现转录下降(与对照组比较,p0.05),GATA3mRNA在免疫后19天下降明显(与对照组比较,p0.05)。 第三部分 β-榄香烯对M OGEAE小鼠早期视神经炎的神经保护作用及干预靶点 目的 研究β-榄香烯对MOGEAE小鼠视神经炎轴索损伤的神经保护作用;明确β-榄香烯如何通过对辅助性T细胞亚群的分化调节及其特异性细胞因子的转录调节实现其神经保护作用,为脱髓鞘性视神经炎的治疗提供新的方法和实验依据。 方法 通过行为学、组织形态学及免疫组织化学技术观察β-榄香烯对EAE小鼠脱髓鞘性视神经炎的神经保护作用,进一步通过分子生物学技术观察β-榄香烯对辅助性T细胞亚群特异性细胞因子的转录因子及调节因子的mRNA的表达影响。 结果 1、行为学改变:β-榄香烯能改善EAE小鼠的神经功能评分(与对照组比较,p0.05)。 2、组织形态学改变:β-榄香烯能减轻EAE小鼠轴索及髓鞘损伤。 3、免疫组织化学改变:β-榄香烯可减少EAE小鼠p-APP蛋白表达及增加CNPase蛋白表达(与对照组比较,p0.05),减轻轴索及髓鞘损伤。 4、分子生物学改变:免疫后11天,p-榄香烯可减少EAE小鼠视神经细胞因子IL-17、转录因子RORγt、分化调节因子IL-6、及IL-23p19的mRNA的表达(与对照组比较,p0.05);同时增加FOXP3、Socs3mRNA的表达(与对照组比较,p0.05)。免疫后19天,β-榄香烯可减少EAE小鼠视神经细胞因子IFN-γ、转录因子T-beta、分化调节因子IL-12p35的mRNA的表达(与对照组比较,p0.05);同时增加GATA3mRNA的表达,并维持FOXP3mRNA的较高水平表达(与对照组比较,p0.05)。 结论 1、MOG EAE小鼠模型早期视神经可见轴索及髓鞘损伤,且轴索损伤并非完全继发于脱髓鞘损伤。 2、Th17亚群在脱髓鞘性视神经炎的早期始动了特异性的免疫应答,Th1亚群在维持特异性免疫应答过程中发挥重要作用,Treg亚群不仅在发病早期抑制异常的免疫应答,而且在发病的高峰期同Th2亚群共同负调控免疫应答。 3、β-榄香烯可改善脱髓鞘性视神经炎早期的脱髓鞘及轴索损伤,改善临床症状。 4、p-榄香烯可下调Th17及Th1细胞因子的表达,上调Treg细胞因子的表达,进而逆转Th17/Treg、Th1/Th2极化;β-榄香烯通过对辅助性T细胞亚群特异性细胞因子的转录因子及调节因子的mRNA表达的影响发挥神经保护作用。


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